紅景天苷促進培養(yǎng)乳鼠心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放*

龐勇軍， 孫 莉， 謝文娟， 莫書榮

(桂林醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室，3組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，4生藥學(xué)教研室，廣西 桂林 541004;2廣西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

紅景天是多年生草本植物，為景天科景天屬。紅景天具有悠久的應(yīng)用歷史，被譽為“高原人參”，紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天中的主要有效成分之一［1］，具有抗缺氧、抗疲勞、保護心肌和增強收縮力作用［2］。紅景天苷能提高心臟泵血功能、有效擴張冠狀動脈，能減少心肌缺血梗死區(qū)面積。紅景天苷具有內(nèi)在的強心作用，在血壓不變時，增加心肌收縮力，增強心肌的收縮舒張速度，能改善心臟的泵血能力［3］。以往文獻報道都是通過在體或離體器官實驗證實紅景天苷具有正性肌力作用，本實驗以體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞為基礎(chǔ)，觀察紅景天苷對心肌細胞胞內(nèi)游離鈣濃度變化的影響，并探討其可能的正性肌力作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 1－3 d齡SD大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證號為SCXK桂2009－0002，使用許可證號為SYXK桂2009－0004。

1.2 試劑 DMEM液，D－Hanks液(不含鈣鎂)，胰蛋白酶，膠原酶Ⅰ(Sigma);新生牛血清(四季青公司);5'－溴－2'－脫氧尿苷(BrdU，Sigma)和臺盼藍(Sigma);Fluo－3/AM，鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司);紅景天苷(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)。培養(yǎng)液Ⅰ:H－DMEM中加入10%滅活新生牛血清。培養(yǎng)液Ⅱ:H－DMEM中加入10%滅活新生牛血清及終濃度0.1 mmol/L BrdU。

1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma 3111)，熒光倒置顯微鏡(Olympus)，自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，分析天平(BS124S賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，實時全光譜共聚焦顯微鏡(NikonA1)，精密pH計(PHS－3B上海虹益儀表有限公司)，低速臺式離心機(TDL－60B上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 新生大鼠心肌細胞的分離、純化及培養(yǎng) 用DMEM配制0.1%胰蛋白酶，0.1%膠原酶Ⅰ，0.22 μm濾菌器過濾，37℃預(yù)熱。取1－3 d齡的SD新生大鼠12只，麻醉后用75%乙醇噴淋，1 min后用溫潔凈水沖洗掉黃色排泄物后擦干乳鼠。在無菌間操作臺取心臟，用左手拇指和食指捏住乳鼠頸背部皮膚，用2%碘酊、75%乙醇依次消毒胸腹部皮膚，用直眼科剪從劍突下沿胸骨中線剪開胸骨至鎖骨，心臟暴露良好，用彎眼科鑷將心室夾出，置于裝有4℃預(yù)冷不含Ca2+、Mg2+的D－Hanks液的培養(yǎng)皿中。在超凈工作臺內(nèi)將心室剪成兩瓣，沖洗3次;將心肌移入青霉素瓶中，加入1 mL D－Hanks液，用彎眼科剪將心肌剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，用吸管將組織塊移入5 mL的刻度離心管，棄上清，重復(fù)洗滌1次，洗盡污血。加入0.1%胰蛋白酶溶液1 mL、0.1%膠原酶Ⅰ1 mL反復(fù)吹打3 min后棄上層混懸液，再加入胰蛋白酶溶液1 mL，膠原酶Ⅰ1 mL吹打3 min后吸取上清液，移入2支10 mL刻度離心管(每支預(yù)加入5 mL培養(yǎng)液Ⅰ)終止消化;再重復(fù)3次，即可基本消化完組織塊。將4次所得消化液以1000 r/min，離心8 min，棄上清。加培養(yǎng)液Ⅰ4 mL重懸，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，移至培養(yǎng)瓶，置飽和濕度、37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。2 h后輕搖吸出細胞懸液計數(shù)，調(diào)密度成5×108cells/L的細胞懸液，按1 mL/well接種于直徑3.5 mm激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，12 h后換培養(yǎng)液Ⅱ培養(yǎng)。2 d后換培養(yǎng)液Ⅰ培養(yǎng)，以后每隔1 d換1次培養(yǎng)液。

2.2 Fluo－3/AM 的負載 將50 μg Fluo－3/AM 用88.5 μL二甲亞砜(DMSO)配成500 μmol/L儲備液，分裝11管 EP管，每管8 μL，置－20℃冰箱保存。臨用加培養(yǎng)液Ⅰ792 μL配成5 μmol/L。心肌細胞培養(yǎng)4 d后，用無鈣D－Hanks液洗滌細胞3次，于室溫避光條件下用Fluo－3/AM負載細胞40 min，用無鈣D－Hanks液洗去細胞外殘余染料后，加入培養(yǎng)液200 μL，送實時全光譜激光共聚焦顯微鏡檢測。

2.3 細胞內(nèi)游離鈣的測定 常溫條件下，培養(yǎng)心肌細胞加樣200 μL后隨即在激光共聚焦顯微鏡下動態(tài)觀察胞漿內(nèi)Ca2+熒光強度變化，掃描細胞內(nèi)熒光強度變化圖像，每隔2 s掃描1次，連續(xù)掃描6min，并采圖。以平均熒光強度變化反映［Ca2+］i的相對水平。激光共聚焦系統(tǒng)采用 NIS－Elements AR3.1軟件控制，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm。

2.4 實驗分組 取培養(yǎng)4 d的細胞分為正常對照組(給予等量200 μL D－Hanks液);紅景天苷不同劑量組(15 mg/L，30 mg/L和60 mg/L);維拉帕米阻斷+紅景天苷不同劑量組(15 mg/L，30 mg/L 和60 mg/L)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 D－Hanks液對細胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度的影響

對照組在 DMEM 中加入D－Hanks液200 μL，每隔2 s掃描1次，連續(xù)掃描6 min，細胞內(nèi)游離Ca2+平均熒光強度無明顯變化，細胞內(nèi)Ca2+熒光強度在激光掃描參數(shù)不變的情況下具有較好的穩(wěn)定性。

2 不同濃度的紅景天苷對細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

分別加入15 mg/L、30 mg/L和60 mg/L紅景天苷時，心肌細胞內(nèi)［Ca2+］i升高，Ca2+平均熒光強度由基礎(chǔ)值524.11±3.11、530.61±4.40和532.24±3.40分別上升到574.08±4.65、591.86±3.64和618.66±4.27，差異顯著(P ＜0.01)，呈劑量依賴性。達峰時間為(5.38±1.87)s、(5.63±2.11)s和(6.90±1.87)s(P＞0.05)，無時間依賴性。

3 紅景天苷對維拉帕米阻斷膜鈣通道后細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

加入200 μL 10 mg/L維拉帕米后，可見心肌細胞內(nèi)Ca2+熒光亮度降低，掃描6 min結(jié)束時細胞內(nèi)游離鈣離子平均熒光強度仍保持低水平無明顯變化，加入紅景天苷后，心肌細胞內(nèi)Ca2+熒光亮度升高，平均熒光強度由維拉帕米阻斷的357.74±3.13、387.17±2.37和391.43±1.34分別上升到480.86±3.98、496.70±3.08和522.18±3.19，差異顯著(P＜0.01)，呈劑量依賴性。達峰時間為(5.13±1.55)s、(5.62±1.80)s和(6.14±2.18)s(P＞0.05)，無時間依賴性，見表1。

4 維拉帕米及紅景天苷對心肌細胞內(nèi)游離Ca2+熒光圖像的影響

激光共聚焦顯微鏡下可見對照組平均熒光強度穩(wěn)定(圖1A);加入維拉帕米后，熒光強度下降(圖1B);加入紅景天苷后，熒光強度增強(圖1C)。

表1 紅景天苷對乳鼠心肌細胞內(nèi)游離鈣離子熒光值的影響Table 1.Effect of salidroside on［Ca2+］iin cultured neonatal rat cardiomyocytes(.n=5)

表1 紅景天苷對乳鼠心肌細胞內(nèi)游離鈣離子熒光值的影響Table 1.Effect of salidroside on［Ca2+］iin cultured neonatal rat cardiomyocytes(.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs verapamil+15 mg/L salidroside group.

Group Dose(mg/L) Basal value Peak value Peak time(s)Control 528.77 ±3.51 528.82 ±3.45 9.55 ±4.89 Salidroside 15 524.11 ±3.11 574.08 ±4.65＊＊ 5.38 ±1.8730 530.61 ±4.40 591.86 ±3.64＊＊ 5.63 ±2.1160 532.24 ±3.40 618.66 ±4.27＊＊ 6.90 ±1.87 Verapamil+Salidroside 15 357.74 ±3.13 480.86 ±3.98＊＊ 5.13 ±1.55 Verapamil+Salidroside 30 387.17 ±2.37 496.70 ±3.08＊＊## 5.62 ±1.80 Verapamil+Salidroside 60 391.43 ±1.34 522.18 ±3.19＊＊#6.14 ±2.18

Figure 1.Changes of free Ca2+concentration in cytoplasm of cardiomyocytes observed by laser confocal microscopy(×100).A:the fluorescence intensity of control group;B:the intracellular fluorescence intensity was decreased by verlapamil;C:the intracellular fluorescence intensity was increased by salidroside.圖1 激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察搏動心肌細胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化

討 論

鈣離子對細胞內(nèi)大部分生理生化活動有著十分重要的調(diào)節(jié)作用，心肌細胞內(nèi)升高的Ca2+直接引起心肌收縮的同時作為第二信使參與其它多種鈣依賴蛋白酶活性的調(diào)節(jié)。鈣通道分鈣釋放通道和鈣進入通道兩類，心肌鈣通道通過調(diào)節(jié)Ca2+跨膜運動的量和速度，直接影響心肌電興奮的傳導(dǎo)及收縮功能。在正常靜息條件下，心肌細胞內(nèi)的［Ca2+］i非常低(10－300 nmol/L)，在興奮條件下生理濃度可達到1 μmol/L以上，細胞內(nèi)鈣池的［Ca2+］i可達10－3mol/L水平，鈣池中Ca2+經(jīng)鈣釋放通道外流到胞漿，肌質(zhì)網(wǎng)上有ryanodine受體(RyR)通道和少量三磷酸肌醇受體(IP3R)通道，心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)膜上的ryanodine受體通道在調(diào)節(jié)心肌興奮－收縮偶聯(lián)中起關(guān)鍵作用［4］。心肌細胞內(nèi)的自由Ca2+主要源自肌質(zhì)網(wǎng)，90%是由肌質(zhì)網(wǎng)釋放的［5］。因此在調(diào)節(jié)心肌興奮－收縮偶聯(lián)過程中，心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+在引起胞內(nèi)［Ca2+］i變化中起主導(dǎo)作用。

常用于分析細胞內(nèi)［Ca2+］i的流式細胞術(shù)只能分析群體細胞的平均［Ca2+］i，由于群體心肌細胞凋亡的非同步性，單個心肌細胞內(nèi)［Ca2+］i測量結(jié)果并不準確［6］。激光共聚焦顯微鏡能直接測量單個心肌細胞內(nèi)［Ca2+］i，對測量單細胞個體在受到外界刺激時細胞內(nèi)［Ca2+］i動態(tài)變化更有意義。

我們前期研究表明紅景天苷具有增強在體和離體心臟的心肌收縮能力，有加快心肌收縮速度的作用。本實驗表明，在無外鈣D－Hanks液中紅景天苷能升高心肌細胞內(nèi)［Ca2+］i，有劑量依賴性而無時間依賴性。

心肌型ryanodine受體(RyR2)位于心肌細胞的肌質(zhì)網(wǎng)上，肌質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+通過RyR2通道的釋放引起心肌的收縮，在心肌興奮－收縮偶聯(lián)中起著至關(guān)重要的作用［7］。RyR2功能異常是心律失常、心力衰竭發(fā)生的重要原因［8］。Ca2+誘導(dǎo)Ca2+釋放機制提示胞膜外的Ca2+內(nèi)流使細胞內(nèi)［Ca2+］i升高，但其不能直接引起心肌收縮，而是觸發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通道使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+大量釋放而引起心肌收縮［9］。RyR2活性受多種因素的影響和調(diào)節(jié):(1)細胞內(nèi)的過程，包括磷酸化、氧化;(2)生理調(diào)節(jié)因子，包括 Ca2+、Mg2+、ATP;(3)藥物調(diào)節(jié)因子［10］。加入Ca2+通道阻滯劑維拉帕米阻斷心肌細胞膜外Ca2+內(nèi)流后，加入紅景天苷，可引起細胞內(nèi)［Ca2+］i升高，說明紅景天苷能促進細胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)鈣的釋放，因排除了細胞外的鈣內(nèi)流因素，紅景天苷提高細胞內(nèi)［Ca2+］i的機制可能是否通過直接作用于RyR2而起作用。

本實驗結(jié)果提示紅景天苷能促進心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放Ca2+，增加細胞內(nèi)［Ca2+］i，從細胞水平進一步證實了紅景天苷對心肌具有正性肌力作用。對于紅景天苷是否通過影響肌漿網(wǎng)ryanodine敏感受體或是IP3受體而引起細胞內(nèi)［Ca2+］i升高，有待進一步研究。

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