王愛英,王勤(1.甘肅張掖市人民醫(yī)院,張掖市734000;2.甘肅張掖市食品藥品檢驗(yàn)所,張掖市734000)
增液承氣口服液是在增液承氣湯的基礎(chǔ)上創(chuàng)制而成,由玄參、地黃、麥冬、大黃等4味中藥材組成。增液承氣湯出自清代醫(yī)家吳鞠通《溫病條辨·中焦篇》[1],具有甘涼濡潤(rùn)、滋陰增液、軟堅(jiān)降泄、通腑泄熱之功效,用于溫病陽明腑實(shí)兼陰液虧損之證[2]。臨床上主要用于治療中老年習(xí)慣性便秘[3]、陰虛腸燥便秘[4]、慢性呼吸衰竭[5]、慢性支氣管炎急性發(fā)作[6]、流行性出血熱少尿期[7]等癥,療效確切。隨著增液承氣湯在臨床上的廣泛應(yīng)用,為便于患者服用和攜帶方便,筆者將其研制開發(fā)為增液承氣口服液,并采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)其中5種蒽醌類衍生物進(jìn)行測(cè)定,以達(dá)到控制其內(nèi)在質(zhì)量的目的。
Agilent1100型HPLC儀系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司);Metler-D2025型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);AS3120A型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。
蘆薈大黃素對(duì)照品(批號(hào):110795-201007,含量以98.0%計(jì),以五氧化二磷為干燥劑干燥12 h后用)、大黃酸對(duì)照品(批號(hào):110757-200206)、大黃素對(duì)照品(批號(hào):110756-200110)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào):110796-201017)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào):110758-201013)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;甲醇(色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司);水為重蒸餾水,其余試劑均為分析純;增液承氣口服液(甘肅張掖市人民醫(yī)院自制,批號(hào):20100302、20100701、20100902、20100903、20101101)。
色譜柱:Eclipse XDB C18(150 mm×4.6 mm,5μm);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液(88∶12);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;以外標(biāo)法定量。結(jié)果表明,陰性對(duì)照對(duì)含量測(cè)定無干擾;理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜見圖1。
分別精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品8.38 mg、大黃酸對(duì)照品8.78 mg、大黃素對(duì)照品8.52 mg、大黃酚對(duì)照品8.70 mg、大黃素甲醚對(duì)照品4.78 mg,置于100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,分別制成每1 mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各約80 μg,大黃素甲醚約40 μg的溶液,作為對(duì)照品貯備液;分別精密量取上述對(duì)照品貯備液各2 mL,混勻,即得混合對(duì)照品溶液(每1 mL含蘆薈大黃素16.76 μg、大黃酸17.56 μg、大黃素17.04 μg、大黃酚17.40 μg、大黃素甲醚9.56 μg)。
圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品;B.供試品;C.陰性對(duì)照;1.蘆薈大黃素;2.大黃酸;3.大黃素;4.大黃酚;5.大黃素甲醚Fig1 HPLC chromatogramsA.mixed control;B.test sample;C.negative control;1.aloe-emodin;2.rhein;3.emodin;4.chrysophanol;5.physcion
精密量取本品2 mL,置蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,加8%鹽酸溶液10 mL,超聲(工作頻率:40 kHz,功率:250 W)處理2 min,再加三氯甲烷15 mL,加熱回流1 h,放冷,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗滌容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷層,酸液再用三氯甲烷提取3次,每次15 mL,合并三氯甲烷液,減壓回收溶劑至干,殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至100 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
按處方制備工藝制成缺大黃的陰性樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。
精密吸取上述混合對(duì)照品溶液4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL,按上述色譜條件分別進(jìn)樣,測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(X,μg)為橫坐標(biāo),峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得蘆薈大黃素的回歸方程為Y=4 739.67X+3.28(r=0.999 6,n=5)、大黃酸的回歸方程為Y=3 959.48X+2.32(r=0.999 8,n=5)、大黃素的回歸方程為Y=3 200.47X+6.94(r=0.999 9,n=5)、大黃酚的回歸方程為Y=4 992.46X+32.29(r=0.999 9,n=5)、大黃素甲醚的回歸方程為Y=4 730.59X-1.71(r=0.999 7,n=5)。結(jié)果表明,5種成分進(jìn)樣量分別在0.067~0.335、0.070~0.351、0.068~0.341、0.070~0.348、0.038~0.191 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。
精密吸取混合對(duì)照品溶液適量,在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定。結(jié)果,蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.36%、0.63%、0.95%、1.02%、1.81%(n=6),表明儀器精密度良好。
取同一批樣品(批號(hào):20100902)適量,共6份,分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.10”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果,蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為 0.56、0.44、0.81、0.35、0.27 mg·mL-1,RSD分別為1.29%、0.87%、0.54%、0.75%、1.88%(n=6),表明本方法重復(fù)性良好。
取同一供試品溶液適量,分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定。結(jié)果,蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為0.54、0.44、0.82、0.37、0.26 mg·mL-1,RSD分別為1.13%、0.98%、0.91%、1.52%、1.97%(n=5),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
取已知含量的同一批樣品(批號(hào):20100902)適量,共9份,每3份為一組,各加入一定量的對(duì)照品溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.10”項(xiàng)下方法測(cè)定樣品含量,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表1。
表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 1Results of recovery tests(n=9)
續(xù)表1 Continued Tab1
取5批樣品,分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液適量,經(jīng)0.45μm針筒過濾器過濾,精密吸取10μL進(jìn)樣,用峰面積按外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種蒽醌類衍生物的含量,結(jié)果見表2。
表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab 2Results of content determination of samples(n=3)
在流動(dòng)相的優(yōu)化中,選用了乙腈、甲醇、磷酸系統(tǒng)的不同配比(80∶20、85∶15和88∶12)進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果隨著乙腈、甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大,蒽醌類衍生物的保留時(shí)間相對(duì)減少;當(dāng)以甲醇-0.1%磷酸溶液(88∶12)為流動(dòng)相時(shí),能夠獲得較好的分離效果和較短的分離時(shí)間,理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000,所以選擇此流動(dòng)相系統(tǒng)作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。
在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),從DAD檢測(cè)器收集到的信息可知,蒽醌類衍生物在(225±2)、(254±2)、(428±2)nm波長(zhǎng)處均有最大吸收,但從三維圖譜結(jié)果來看,(254±2)nm波長(zhǎng)處的響應(yīng)值較其他兩處大,故在上述色譜條件下確定254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明,5批增液承氣口服液中的5個(gè)指標(biāo)性成分含量差異較大,這可能與原料的質(zhì)量和生產(chǎn)工藝有關(guān)。根據(jù)單味藥大黃的含量限度,結(jié)合本制劑中大黃所加量和制劑工藝,建議本品總蒽醌的含量限度為:本品每1 mL含大黃以5種蒽醌類衍生物的總量計(jì),不得少于2.0 mg。
本試驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng),經(jīng)三氯甲烷提取后可排除其他非測(cè)定物質(zhì)的干擾,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可作為該制劑的質(zhì)量控制手段。
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