王淑梅,張志清,楊秀嶺,王楠,張君(.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,石家莊市050000;.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,石家莊市 05007)
多索茶堿(Doxofylline)為新型的非腺苷阻滯性支氣管擴(kuò)張藥,具有平喘、抗炎和鎮(zhèn)咳作用。其療效較茶堿強(qiáng),耐受性好,且不良反應(yīng)較茶堿少,在治療支氣管痙攣方面可能成為茶堿替代品[1]。文獻(xiàn)[2]報(bào)道,多索茶堿對(duì)血管有獨(dú)特的耐受性,對(duì)中樞神經(jīng)和胃腸道等無(wú)影響;對(duì)患有嚴(yán)重肝功能損害或伴隨喹諾酮類藥物治療的患者應(yīng)進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定多索茶堿血藥濃度已有文獻(xiàn)報(bào)道[3,4],樣品處理方法主要有沉淀蛋白法和提取法。本試驗(yàn)采用RPHPLC法對(duì)人血清中多索茶堿的濃度進(jìn)行測(cè)定,并探索和改進(jìn)方法,現(xiàn)報(bào)道如下。
高效液相色譜儀,包括515泵、486檢測(cè)器、Rheodyne 7725i進(jìn)樣閥、Empower Pro工作站(美國(guó)Waters公司);GL-20G-Ⅱ離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);GL-88B渦旋混合器(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠);CPA225D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。
多索茶堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):100625-200301);內(nèi)標(biāo):咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):171215-200608);甲醇為色譜純,異丙醇和三氯甲烷為分析純??瞻籽逵山】凳茉囌咛峁?。
色譜柱:Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(30∶70);流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):272 nm;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30 ℃。
2.2.1 多索茶堿對(duì)照品貯備液:準(zhǔn)確稱取多索茶堿對(duì)照品50.80 mg,置于50 mL容量瓶中,加甲醇溶液溶解、定容,得質(zhì)量濃度為1 016 μg·mL-1的多索茶堿對(duì)照品貯備液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液:準(zhǔn)確稱取咖啡因?qū)φ掌?1.20 mg,置于50 mL容量瓶中,加甲醇溶液溶解、定容,精密吸取1.5 mL該溶液置于50 mL容量瓶中,以甲醇定容,得質(zhì)量濃度為30.72 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
取血清樣品0.4 mL,加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL,再加入異丙醇-三氯甲烷(1∶4)5 mL,渦旋混合1 min,4 000 r·min-1離心10 min,取下清液4 mL置于離心管中,50℃恒溫水浴中氮?dú)獯蹈?,殘?jiān)恿鲃?dòng)相100 μL溶解,取20 μL進(jìn)樣。
在“2.1”項(xiàng)色譜條件下,血清中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾,多索茶堿與內(nèi)標(biāo)峰形良好,分離完全,其保留時(shí)間分別為9.5、6.4 min。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 高效液相色譜圖A.空白血清;B.空白血清+多索茶堿對(duì)照品+內(nèi)標(biāo);1.多索茶堿;2.咖啡因Fig1 HPLC chromatogramsA.blank serum;B.blank serum+reference substance+internal substance;1.doxofyline;2.caffeine
精密量取空白血清0.4 mL,加入多索茶堿系列對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL,搖勻,使多索茶堿濃度分別為0.101 6、0.254、0.508、1.016、2.302、4.064、8.128 μg·mL-1,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,記錄色譜。以多索茶堿濃度(X)為橫坐標(biāo),多索茶堿與咖啡因峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.986 8X+0.022 8(r=0.999 8)。結(jié)果表明,多索茶堿血藥濃度在0.1016~8.128 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低檢測(cè)濃度為0.011 μg·mL-1。
2.6.1 提取回收率:分別配制低、中、高(0.254、1.016、4.064 μg·mL-1)3種濃度的血清對(duì)照品溶液各3份,按“2.3”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定,以所得的色譜峰面積與相應(yīng)濃度多索茶堿對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積進(jìn)行比較,考察樣品提取回收率。3種濃度下多索茶堿提取回收率分別為93.59%、95.52%和92.32%,RSD分別為5.55%、2.22%和3.75%。
2.6.2 方法回收率:分別配制低、中、高(0.254、1.016、4.064 μg·mL-1)3種濃度的血清樣品各3份,按“2.3”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定,測(cè)得多索茶堿濃度,以實(shí)測(cè)濃度與加入濃度之比計(jì)算方法回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。
分別配制低、中、高(0.254、1.016、4.064 μg·mL-1)3種濃度的血清樣品各3份,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,于同日內(nèi)和5 d分別進(jìn)樣分析,測(cè)定日內(nèi)及日間精密度,結(jié)果見(jiàn)表1。
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表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Tab 1Results of recovery and precision test(±s,n=3)
表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Tab 1Results of recovery and precision test(±s,n=3)
加入濃度/μg·mL-1 RSD/%4.65 8.60 3.74測(cè)得濃度/μg·mL-1方法回收率/%RSD/%0.254 1.016 4.064 0.214 8±0.01 0.953 3±0.07 3.77 7±0.11 84.57 93.82 92.93 4.65 7.34 2.91日內(nèi)精密度測(cè)得濃度/μg·mL-1 0.214 8±0.01 0.953 3±0.07 3.77 7±0.11 RSD/%4.65 7.34 2.91日間精密度測(cè)得濃度/μg·mL-1 0.214 7±0.01 0.929 6±0.08 4.011±0.15
配制中濃度(1.016 μg·mL-1)的血清樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,分別在0、2、4、8 h時(shí)測(cè)定,記錄色譜峰面積,計(jì)算多索茶堿含量。結(jié)果表明,處理后的血清樣品室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定,RSD=1.13%(n=3)。另配制中濃度的血清樣品,反復(fù)凍融(-20℃)3次后,按“2.3”項(xiàng)下方法操作。結(jié)果表明,樣品反復(fù)凍融3次后性質(zhì)穩(wěn)定,RSD=1.60%(n=3)。
本試驗(yàn)通過(guò)查閱文獻(xiàn),優(yōu)選出的色譜條件以甲醇-水(30∶70)為流動(dòng)相,配比簡(jiǎn)單,性質(zhì)穩(wěn)定,內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。內(nèi)標(biāo)咖啡因在該色譜條件下,與多索茶堿完全分離,峰形和保留時(shí)間均較理想。樣品處理采用異丙醇-三氯甲烷(1∶4)進(jìn)行提取,提取液簡(jiǎn)便易得,可避免因沉淀蛋白不完全而造成的色譜柱堵塞。
試驗(yàn)表明,本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好,可用于多索茶堿的血藥濃度測(cè)定及其臨床藥動(dòng)學(xué)研究。
[1]顧 健,張春燕,曹兆龍,等.多索茶堿片在中國(guó)人的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)新藥雜志,2000,9(6):396.
[2]徐彥貴,卜一珊,何振梅,等.RP-HPLC法測(cè)定人血漿中多索茶堿濃度[J].中國(guó)藥師,2002,5(8):467.
[3]張 波,劉 艷,杜智敏,等.反相高效液相色譜法測(cè)定血漿中多索茶堿的濃度[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,38(1):88.
[4]闞全程,李朵璐,師秀琴.HPLC測(cè)定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶堿濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究[J].藥物分析雜志,2009,29(5):845.