鄭陽(yáng)霞 唐海東 李煥秀 賀忠群 秦耀國(guó)

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安 625014）

西瓜〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕是一種嚴(yán)忌重茬的蔬菜，極易發(fā)生連作障礙。其原因除了土傳病害和土壤理化性狀劣變外，自毒作用也是重要的因素之一（喻景權(quán)和杜堯舜，2000）。而且自毒作用可協(xié)同土傳病害發(fā)生，導(dǎo)致連作障礙嚴(yán)重發(fā)生（喻景權(quán)和杜堯舜，2000）。自毒作用是指植物向環(huán)境釋放某些化學(xué)物質(zhì)而影響自身的生長(zhǎng)和發(fā)育的化學(xué)生態(tài)現(xiàn)象和化感作用的表現(xiàn)形式（Singh et al.，1999）?；形镔|(zhì)主要是通過(guò)植物地上部的淋溶和揮發(fā)、根系的分泌以及植株殘?bào)w的分解等途徑向農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中釋放，從而影響周圍和后茬植物的生長(zhǎng)發(fā)育（章家恩，2007；覃逸明 等，2009）。目前有關(guān)西瓜連作障礙中的自毒作用已有一些報(bào)道。王倩（2002）、耿廣東等（2005）、楊廣超等（2005）證實(shí)西瓜根、莖葉殘?bào)w的水浸提液對(duì)西瓜的生長(zhǎng)有一定的毒害作用?；形镔|(zhì)廣泛存在于植物的各個(gè)組織，而且各組織中分布不同。但有關(guān)西瓜根、莖葉浸提液以及根系分泌物中化感物質(zhì)的檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道，因此有必要深入研究西瓜的化感作用。本試驗(yàn)研究了不同濃度的西瓜根、莖葉水浸提液和根系分泌物對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響，并應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)，探討西瓜化感作用的機(jī)理，比較西瓜根、莖葉水浸提液及其根系分泌物化感作用的差異，分析其化感物質(zhì)的種類，為解決生產(chǎn)實(shí)踐中的西瓜連作障礙提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試西瓜品種為早佳84-24，新疆葡萄瓜果研究開(kāi)發(fā)中心選育。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試材料的培養(yǎng) 試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜基地進(jìn)行。2010年5月3日播種西瓜，待幼苗長(zhǎng)至3～4片葉時(shí)移入內(nèi)徑為20 cm的塑料缽中，基質(zhì)為珍珠巖。每缽定植2株，共15缽。每7 d澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2 根、莖葉水浸提液母液的制備 6月15日將西瓜的根和莖葉用清水洗干凈，放在85 ℃的烘箱中殺酶30 min，再在65 ℃下烘干粉碎。分別稱取20 g干樣放入三角瓶中，加去離子水200 mL，放入超聲波振蕩儀中提取4 h，濾紙過(guò)濾即得濃度為100 g·L-1的水浸提液母液。

1.2.3 根、莖葉化感作用的生物檢測(cè) 分別將西瓜根和莖葉水浸提液母液用去離子水稀釋成2.5、5.0、10.0、20.0 g·L-1進(jìn)行西瓜種子發(fā)芽試驗(yàn)。在直徑12 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪兩層定性濾紙，放入經(jīng)55 ℃溫水浸種的西瓜種子25粒。分別取上述稀釋液7 mL加入培養(yǎng)皿中，以加入7 mL去離子水為對(duì)照，3次重復(fù)。然后置于（25±2）℃人工氣候箱中培養(yǎng)。每天補(bǔ)充適量的水分以保持濾紙濕度。每天觀察、記錄發(fā)芽數(shù)，連續(xù)觀察5 d，計(jì)算發(fā)芽指數(shù)（GI）。第5天測(cè)定總發(fā)芽率。同時(shí)各處理隨機(jī)取樣10株，用直尺測(cè)量株高、根長(zhǎng)，用電子天平稱量冠鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量。

式中Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

化感效應(yīng)分析參照 Willamson和 Richardson（1988）的化感效應(yīng)指數(shù)（RI）進(jìn)行。當(dāng) T≥C時(shí)，RI=1-C/T；當(dāng)T＜C時(shí)，RI=T/C-1，其中T為測(cè)定值，C為對(duì)照值。RI值＞0時(shí)，為促進(jìn)作用；RI值＜0時(shí)，為抑制作用，絕對(duì)值的大小與作用強(qiáng)度一致。均以 RI作為原始數(shù)據(jù)，采用DPS軟件進(jìn)行方差分析。

1.2.4 根、莖葉中化學(xué)物質(zhì)的鑒定 分別取西瓜的根和莖葉研碎后的粉末20 g，加入正己烷100 mL，放入超聲波振蕩儀提取4 h。然后用定量濾紙過(guò)濾2次，再用0.45 pm微孔濾膜過(guò)濾，收集提取液。最后將提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃濃縮到2 mL，放入4 ℃冰箱中保存。

應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）檢測(cè)根和莖葉中的化學(xué)成分。氣相色譜儀：Agilent 6890N；質(zhì)量選擇檢測(cè)器：Agilent Technologies 5973；分析軟件：Agilent Chemstation；色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm，HP-5MS毛細(xì)管柱。柱箱升溫程序：90 ℃（1 min），以10 ℃·min-1升溫至240 ℃。載氣流速：1.0 mL·min-1（He），進(jìn)樣量為1 μL。離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；電極電壓：1 000 V；四極桿溫度：150 ℃，全掃描范圍30～600 m·Z-1。通過(guò)Agilent Chemstation化學(xué)工作站檢索Nist標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，確定化合物。采用歸一法計(jì)算各種成分的相對(duì)含量。

1.2.5 根系分泌物的收集、濃縮 6月15日將西瓜植株從基質(zhì)中取出，先后用自來(lái)水和去離子水充分清洗附著在根系上的基質(zhì)。然后將根系放在裝有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的黑色塑料桶中，每桶定植5株。連續(xù)通氣培養(yǎng)10 d，收集10株。10 d后將西瓜植株小心地從營(yíng)養(yǎng)液中取出，用定性濾紙過(guò)濾營(yíng)養(yǎng)液，再將營(yíng)養(yǎng)液以25 mL·min-1的流速經(jīng)過(guò)XAD-4吸附樹(shù)脂，然后用柱床10倍體積的去離子水多次沖洗柱床（除去營(yíng)養(yǎng)液成分），再用200 mL正己烷洗脫根系分泌物。最后將正己烷洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃濃縮至1 mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 根系分泌物化感作用的生物檢測(cè) 將西瓜根系分泌物濃縮液分別稀釋成2.5、5.0、10.0、20.0 μL·L-1進(jìn)行生物檢測(cè)。準(zhǔn)確吸取不同濃度的稀釋液7 mL，加入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放在50 ℃的烘箱中烘至正己烷完全揮發(fā)后加入7 mL去離子水做種子發(fā)芽試驗(yàn)。方法同1.2.3。

1.2.7 根系分泌物中化學(xué)物質(zhì)的鑒定 方法同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜根、莖葉水浸提液對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

西瓜根、莖葉水浸提液對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)有較大的影響（表1）。與對(duì)照相比，西瓜根、莖葉水浸提液的濃度為2.5 g·L-1時(shí)，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、株高、根長(zhǎng)、冠鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量的化感效應(yīng)指數(shù)（RI）均為正值。當(dāng)濃度為5.0 g·L-1時(shí)，RI值為負(fù)值。隨著濃度的增加，RI值逐漸降低。根、莖葉水浸提液濃度在20.0 g·L-1時(shí)，對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，說(shuō)明西瓜根、莖葉水浸提液對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的雙重效應(yīng)。且同一濃度時(shí)，多表現(xiàn)為西瓜莖葉水浸提液對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用顯著大于根系。

表1 西瓜根、莖葉水浸提液對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2 西瓜根系分泌物對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

西瓜根系分泌物對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響因濃度而異（表2）。當(dāng)根系分泌物濃度為2.5 μL·L-1時(shí)，對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)均表現(xiàn)為促進(jìn)作用。根系分泌物濃度為5.0 μL·L-1時(shí)，開(kāi)始抑制西瓜種子的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng)；隨著濃度的升高，抑制程度加大，而且不同濃度之間差異顯著。同濃度時(shí)，西瓜根系分泌物對(duì)西瓜幼苗根部的影響比地上部明顯。

2.3 西瓜根、莖葉和根系分泌物中化學(xué)物質(zhì)的鑒定

在西瓜根、莖葉和根系分泌物中共檢測(cè)出32種化學(xué)物質(zhì)（表3），且以酯類化學(xué)物質(zhì)最多，有14種，推測(cè)酯類化學(xué)物質(zhì)可能是西瓜主要的自毒物質(zhì)。在西瓜根中檢測(cè)到14種化學(xué)物質(zhì)，莖葉中檢測(cè)到19種，根系分泌物種檢測(cè)到22種；而且同種化學(xué)物質(zhì)在西瓜根、莖葉和根系分泌物中的相對(duì)含量也不相同。說(shuō)明西瓜根、莖葉和根系分泌物中化學(xué)物質(zhì)的種類和含量存在差異。

表2 西瓜根系分泌物對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

表3 西瓜根、莖葉和根系分泌中化學(xué)物質(zhì)鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 西瓜根、莖葉和根系分泌物的化感效應(yīng)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，西瓜根、莖葉水浸提液和根系分泌物對(duì)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)有較大的影響。低濃度時(shí)，促進(jìn)西瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)；高濃度時(shí)，抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。這與前人的研究結(jié)果一致（王倩，2002；耿廣東 等，2005；楊廣超 等，2005）。西瓜根、莖葉水浸提液濃度在2.5 g·L-1時(shí)，促進(jìn)西瓜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)；濃度為5.0 g·L-1時(shí)，開(kāi)始表現(xiàn)為抑制作用；且隨著濃度增大，抑制作用增強(qiáng)。根系分泌物濃度為 5.0 μL·L-1時(shí)，西瓜種子的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng)也開(kāi)始受到抑制。說(shuō)明西瓜根、莖葉和根系分泌物中存在抑制西瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的化感抑制作用。

雖然植物體內(nèi)含有大量的化感物質(zhì)，但由于化感物質(zhì)在植物組織中分布不均衡，導(dǎo)致了各組織化感作用強(qiáng)度不同。苜蓿的根、莖葉、花、種皮均具有化感作用，但以葉片的化感作用最強(qiáng)（Miller，1983；Chung et al.，2000）。辣椒、茄子和棉花的葉片化感效應(yīng)也大于根系（張啟發(fā)等，2007；李彥斌 等，2008；王廣印 等，2009）。本試驗(yàn)也得出相似的結(jié)論，西瓜莖葉的化感作用大于根系。這可能與其根系、莖葉中化感物質(zhì)組成不同有關(guān)。

3.2 西瓜根、莖葉和根系分泌物中的化感物質(zhì)

植物根、莖葉和根系分泌物中含有許多化學(xué)物質(zhì)，既有化感抑制物質(zhì)（自毒物質(zhì)），也有化感促進(jìn)物質(zhì)。迄今為止，在西瓜、番茄、黃瓜、辣椒、茄子等蔬菜作物根系分泌物和植物殘?bào)w中已經(jīng)分離出苯甲酸、肉桂酸、水楊酸、香草醛等多種自毒物質(zhì)（Kim，1989；Yu & Matsui，1994；王茹華 等，2006）。本試驗(yàn)從西瓜根、莖葉和根系分泌物中共檢測(cè)出32種化學(xué)物質(zhì)，其中酯類化學(xué)物質(zhì)最多，有14種；在西瓜根中檢測(cè)到14種化學(xué)物質(zhì)，莖葉中檢測(cè)到19種，根系分泌物中檢測(cè)到22種，其中一些曾被報(bào)道為化感物質(zhì)（韓麗梅 等，2000；何海斌 等，2005；廖薇 等，2006；劉娜 等，2008；耿廣東 等，2009）。

近幾年有研究證明，脂肪酸酯是一類潛在的化感物質(zhì)，如鄰苯二甲酸二乙酯以及鄰苯二甲酸衍生物等（Macias，1995；何海斌 等，2005）。Rumex janonicus是亞熱帶地區(qū)多年生草藥，能夠分泌鄰苯二甲酸二乙酯，對(duì)周圍植物產(chǎn)生化感作用（Keire et al.，2001）。柴強(qiáng)和馮福學(xué)（2007）報(bào)道，玉米根系分泌物中的鄰苯二甲酸是一種自毒作用較強(qiáng)的化感物質(zhì)。本試驗(yàn)在西瓜的根、莖葉和根系分泌物中均檢測(cè)到鄰苯二甲酸二辛酯、鄰苯二甲酸二異丁酯。至于哪些化感物質(zhì)是西瓜的主要自毒物質(zhì)及其作用機(jī)理還需進(jìn)一步探討。

研究中還發(fā)現(xiàn)，西瓜的化感抑制作用存在濃度效應(yīng)。在同一塊土地上，連續(xù)種植西瓜，由于其化感物質(zhì)積累的過(guò)多，抑制西瓜生長(zhǎng)，造成連作障礙。因此西瓜栽培應(yīng)避免連作，采用輪作。輪作后土壤微生物活性得到改善，化感物質(zhì)在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)揮發(fā)、分解或被土壤吸附固定，使自毒物質(zhì)濃度降低，減輕自毒作用。另外，增施有機(jī)肥，可以改善根系分泌物種類，提高土壤微生物活性，促進(jìn)化感物質(zhì)的分解。同時(shí)建議在西瓜生產(chǎn)中，應(yīng)及時(shí)將西瓜的殘株、落葉清理掉，避免其通過(guò)淋溶或腐解的形式進(jìn)入土壤，以減輕化感抑制作用。

柴強(qiáng)，馮福學(xué)．2007．玉米根系分泌物的分離鑒定及典型分泌物的化感效應(yīng)．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，42（5）：43-48．

耿廣東，程智慧，孟煥文，張素勤，曹紅星，趙會(huì)芳．2005．西瓜化感作用及其機(jī)理研究．果樹(shù)學(xué)報(bào)，22（3）：247-251．

耿廣東，張素勤，程智慧．2009．不同化感物質(zhì)對(duì)番茄根系吸收礦質(zhì)元素的影響．中國(guó)蔬菜，（4）：48-51．

韓麗梅，閻飛，王樹(shù)起，鞠會(huì)艷，楊振明，閻吉昌．2000．重迎茬大豆根際土壤有機(jī)化合物的初步鑒定及對(duì)大豆種子萌發(fā)的化感作用．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，11（4）：582-586．

何海斌，陳祥旭，林瑞余，林文雄，何華勤，賈小麗，熊君，沈荔花，梁義元．2005．化感水稻 PI312777苗期根系分泌物中化學(xué)成分分析．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，16（12）：2383-2388．

李彥斌，劉建國(guó)，李鳳，劉淑娟，耿偉．2008．棉花植株水浸提液化感效應(yīng)的研究．中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，16（6）：1489-1494．

廖薇，張健，楊婉身，鄒平，王晗光．2006．青花椒根際土壤化感物質(zhì)成分分析．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，24（1）：47-50．

劉娜，周寶利，李軼修，郝晶，付亞文．2008．茄子/番茄嫁接植株根系分泌物對(duì)茄子黃萎病菌的化感作用．園藝學(xué)報(bào)，35（9）：1297-1304．

覃逸明，黃雨清，聶劉旺，王千，劉欣，周科．2009．鳳丹種胚組培苗的自毒作用研究．核農(nóng)學(xué)報(bào)，23（1）：75-79．

王廣印，韓世棟，謝玉會(huì)，孫曉娜，周秀梅．2009．辣椒植株水浸液對(duì)辣椒和番茄種子萌發(fā)的自毒作用．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，24（3）：123-127．

王倩．2002．西瓜連作障礙中自毒作用及酚酸類物質(zhì)作用機(jī)理的研究〔博士論文〕．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)．

王茹華，周寶利，張啟發(fā)，廉華，付亞文．2006．茄子根系分泌物中香草醛和肉桂酸對(duì)黃萎病的化感效應(yīng)．生態(tài)學(xué)報(bào)，26（9）：3152-3155．

楊廣超，呂衛(wèi)光，朱靜，張春蘭．2005．西瓜根、莖、葉浸提液對(duì)西瓜種子萌發(fā)及幼苗中酶活性的影響．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，14（1）：46-51．

喻景權(quán)，杜堯舜．2000．蔬菜設(shè)施栽培可持續(xù)發(fā)展中的連作障礙問(wèn)題．沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，31（1）：124-126．

章家恩．2007．生態(tài)學(xué)常用試驗(yàn)研究方法與技術(shù)．北京：化學(xué)工業(yè)出版社．

張啟發(fā)，王茹華，范明珠．2007．茄子自毒作用及控制途徑的初步研究．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，19（5）：12-15．

Chung I M，Seigler D，Miller D A，Kyung S H．2000．Autotoxic compounds from fresh alfalfa leaf extracts：identification and biological activity．Journal of Chemical Ecology，26（1）：315-327．

Keire D A，Anton P，F(xiàn)aull K F，Ruth E，Walsh J H，Chew P，Quisimoro D，Territo M，Reeve J R．2001．Diethyl phthalate，a chemotactic factor secreted byHelicobacter pylori．The Journal of Biological Chemistry，276：48847-48853．

Kim Y S．1989．Identification and growth inhibition of phytotoxic substances from tomato plant．Korean Joumal of Botany，32（1）：41-45．

Macias F A．1995．Allelopathy in search for natural herbicide model．ACS Symposium Series，582：310-329．

Miller D A．1983．Allelopathic effects of alfalfa．Journal of Chemical Ecology，9：1059-1072．

Singh H P，Batish D R，Kohli R K．1999．Autotoxicity：concept，organisms，and ecological significance．Critical Reviews in Plant Sciences，18（6）：757-772．

Willamson G B，Richardson D．1988．Bioassays for allelopathy：measuring treatment responses with independent controls．Journal of Chemical Ecology，14（1）：181-187．

Yu J Q，Matsui Y．1994．Phytotoxic substances in root exudates of cucumber（Cucumis sativusL．）．J Chem Ecol，20（1）：21-31．