治療細(xì)菌性疾病的有力武器——噬菌體及其裂解酶

顧敬敏,韓文瑜,路 榮,雷連成,楊勇軍,馮 新,孫長(zhǎng)江,杜崇濤

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春,130062)

隨著對(duì)抗生素大量的使用和無節(jié)制的濫用,人們逐漸發(fā)現(xiàn)了對(duì)各種抗生素不敏感的菌株。20世紀(jì) 40年代,首次分離到對(duì)青霉素有抗性的耐藥菌株,到 60年代,耐藥性菌株已經(jīng)普遍存在[1,2]。像糞腸球菌、不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等病原菌對(duì)大多數(shù)的抗生素都具有很強(qiáng)的耐藥性。尤其是對(duì)革蘭氏陰性菌(如,不動(dòng)桿菌)來說,已經(jīng)可以宣布走到了抗生素時(shí)代的盡頭[3]。

早在 1917年,噬菌體就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),并且之后受到了人們的關(guān)注。但由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)水平有限,對(duì)噬菌體的認(rèn)識(shí)不透徹,因此沒有發(fā)展起來,后來漸漸被人們遺忘。20世紀(jì) 90年代末,鑒于愈來愈嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問題,各國(guó)研究人員又開始重新探索利用噬菌體治療致病性細(xì)菌感染的可行性問題。近幾年,噬菌體重新得到了各國(guó)研究人員的廣泛關(guān)注。隨著科學(xué)的發(fā)展,人們對(duì)噬菌體的研究逐漸深入,噬菌體及其裂解酶的應(yīng)用正在逐步走向成熟。

1 噬菌體及其裂解酶概述

1.1 噬菌體

噬菌體(Bacteriophage,簡(jiǎn)稱phage)又叫細(xì)菌病毒,是一種可以侵入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),通過酶的作用破壞細(xì)胞壁,使細(xì)菌裂解從而將其殺滅的病毒。噬菌體分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體,前者可在敏感宿主菌內(nèi)增殖并使之裂解,亦稱為毒性噬菌體(virulent phage)[4]。

噬菌體對(duì)細(xì)菌的破壞分兩步進(jìn)行[5]:(1)吸附識(shí)別;(2)裂解。

1.2 裂解酶

噬菌體裂解酶(Lysin或Endolysin)是雙鏈 DNA噬菌體所特有的、在病毒復(fù)制晚期合成的一類胞壁質(zhì)水解酶。多數(shù)噬菌體具有編碼 3種細(xì)胞壁水解酶的基因,分別為裂解酶、酰胺酶和內(nèi)肽酶[6],其中酰胺酶是國(guó)內(nèi)外研究比較多的一種裂解酶。裂解酶的高親和性與種屬特異性的細(xì)胞壁糖基有關(guān),而后者常常是細(xì)菌存活的必要成分。因此,細(xì)菌很難產(chǎn)生對(duì)裂解酶的抗性[7]。

2 利用噬菌體對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行治療

2.1 噬菌體對(duì)細(xì)菌性疾病治療的可行性

近期,有很多應(yīng)用噬菌體對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行治療的報(bào)道,充分證明了噬菌體治療的可行性。

波蘭的 Miedzybrodzki等[8]對(duì)經(jīng)過噬菌體治療的伴隨細(xì)菌感染的炎癥反應(yīng)的病人進(jìn)行了回顧性分析,分析結(jié)果表明,在經(jīng)過噬菌體制劑治療后,病人體內(nèi)的C反應(yīng)蛋白(CRP)血清濃度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)都有明顯的降低,而紅細(xì)胞沉淀系數(shù)(ESR)沒有太大的改變。驗(yàn)證了利用噬菌體制劑對(duì)病人實(shí)施治療后,確有消除由細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)的特性。Denou等[9]檢測(cè)了用T4噬菌體對(duì)大腸桿菌引起的腹瀉進(jìn)行了治療后噬菌體在各器官的含量,結(jié)果顯示,噬菌體在盲腸、結(jié)腸的滴度較高,而在小腸的滴度就很低,在血液、肝臟和脾臟沒有檢測(cè)到。治療 1個(gè)月后沒有發(fā)生副反應(yīng),也沒有發(fā)現(xiàn)抗 T4噬菌體的抗體形成。由以上實(shí)例可知,利用噬菌體治療沒有給動(dòng)物和人造成副反應(yīng),噬菌體將可成為一種重要的候選治療制劑。

Nakai等[10]研究了在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用噬菌體防治病原菌感染水生生物的可行性。結(jié)果表明,特定病原菌感染魚群時(shí),在附近總能分離出烈性噬菌體;當(dāng)病原菌感染魚體內(nèi)部時(shí),噬菌體也會(huì)在體內(nèi)找到,并能長(zhǎng)期存在;無論是實(shí)驗(yàn)條件下還是自然條件下,在魚體內(nèi)都不易產(chǎn)生噬菌體的抗體。

2.2 應(yīng)用純化噬菌體治療細(xì)菌感染

噬菌體可以特異性的殺滅病原菌,而不影響正常菌群的存在。Wang等[11]腹腔注射純化的噬菌體,以治療被耐 β-內(nèi)酰胺類抗生素綠膿桿菌感染的小鼠,收到了良好的效果。Capparelli等[12]對(duì)感染金葡菌(包括 MRSA)的小鼠進(jìn)行了噬菌體的治療。結(jié)果表明,噬菌體在體內(nèi)和體外都可以殺滅受感染巨噬細(xì)胞內(nèi)部的金葡菌。Biswas等[13]對(duì)一株臨床分離到的耐萬古霉素的糞腸球菌引起的小鼠菌血癥進(jìn)行了噬菌體治療。研究表明,感染 45m in后用噬菌體進(jìn)行治療,治愈率可達(dá) 100%,即使小鼠處于頻死狀態(tài)時(shí)再用噬菌體進(jìn)行治療,治愈率也可達(dá) 50%。Chibani-Chennoufi[14]與Vinodkumar[15]也分別利用經(jīng)過純化的噬菌體對(duì)大腸桿菌感染和患多重耐藥的綠膿桿菌性敗血癥的小鼠進(jìn)行了治療,效果非常好,遠(yuǎn)勝過抗生素的治療。

除了以上用途,另外還可以將純化的噬菌體用于食品加工過程中,以防止細(xì)菌對(duì)食品的污染。García等[16]將烈性噬菌體應(yīng)用到凝乳的加工過程中,對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行生物控制,為乳制品加工廠解決了金葡菌污染的問題。

2.3 應(yīng)用半衰期較長(zhǎng)的噬菌體治療細(xì)菌感染

1996年Merril等[17]通過將噬菌體在小鼠體內(nèi)連續(xù)的傳代培養(yǎng),篩選出了能在機(jī)體內(nèi)有較長(zhǎng)半衰期的噬菌體變異株。其中篩選到了具有長(zhǎng)期循環(huán)特性的大腸桿菌λ噬菌體和鼠傷寒沙門氏菌 P22噬菌體。到 2005年,Vitiello等[18]又對(duì)分離出的具有長(zhǎng)期循環(huán)特性的大腸桿菌λ噬菌體進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)傳代后的噬菌體上E蛋白的一個(gè)氨基酸發(fā)生了替換。正是因?yàn)檫@一小小的變化使它在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在的時(shí)間延長(zhǎng)了 1 000倍以上。

2.4 應(yīng)用廣譜噬菌體治療細(xì)菌感染

一般外傷感染是由幾個(gè)同種不同型的病原菌,甚至不同病原菌混合感染引起的,所以廣譜噬菌體治療具有更高的可行性。Wu等[19]以肺炎克雷伯菌為宿主菌在醫(yī)院樣品中分離到 1株噬菌體,命名為Kpp95,遺傳物質(zhì)為雙股DNA,與T4噬菌體形態(tài)相似,它具有很寬的噬菌譜,除肺炎克雷伯菌(對(duì) 107株肺炎克雷伯菌中的 65株有裂解作用)外,還能裂解催產(chǎn)克雷白(氏)桿菌、聚團(tuán)腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌。這種寬譜噬菌體在感染性疾病的治療上具有很大的潛力。

Josephsen等[20]對(duì) 11年前后在干酪車間乳清中分離出的噬菌體進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)“新”噬菌體比“老”噬菌體的裂解能力和裂解譜都增強(qiáng)了很多,致使發(fā)酵無法進(jìn)行。Scholl等[21]的研究發(fā)現(xiàn)由于噬菌體 K1-5能編碼 2種尾絲蛋白,所以可以識(shí)別并裂解 2種大腸桿菌(K1和 K5)。這為人工改造噬菌體、增強(qiáng)其裂解譜提供了新的思路。

2.5 應(yīng)用混合噬菌體治療細(xì)菌感染

對(duì)不同菌株的噬菌體混在一起,制成“雞尾酒”,“拓寬”噬菌體的裂解譜,可以彌補(bǔ)特異性太強(qiáng)的缺點(diǎn),使噬菌體治療的應(yīng)用性加強(qiáng)。Niu等[22]對(duì)臨床上感染大腸STECO 157:H 7的牛和人進(jìn)行了雞尾酒噬菌體的治療。結(jié)果表明,混合噬菌體的治療效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用純的噬菌體(即使純噬菌體的裂解力強(qiáng)于混合噬菌體中的每一種噬菌體)。Denou等[9]的研究也表明混合噬菌體在很多時(shí)候優(yōu)于純的噬菌體制劑。他對(duì)利用 T4噬菌體治療由大腸引起的小鼠腹瀉的潛力和可能存在的問題作了研究。T4噬菌體不但具有屬特異性,甚至有型特異性,單獨(dú)使用一種純的噬菌體效果不佳,因此利用該類噬菌體治療大腸引起的腹瀉時(shí)必須將幾種噬菌體混到一起,形成噬菌體“雞尾酒”,才能更有效的對(duì)腹瀉進(jìn)行治療。Tanji等[23]也利用噬菌體“雞尾酒”對(duì)由大腸桿菌O 157:H 7引起胃腸感染的小鼠進(jìn)行了治療。

Merabishvili等[24]的研究團(tuán)隊(duì)研制出了治療燒傷后由綠膿桿菌和金葡菌引感染的噬菌體“雞尾酒”制劑。他們通過對(duì)該制劑進(jìn)行最適 pH、致熱原的有無、無菌檢驗(yàn)、透射電鏡觀察、溫和噬菌體的剔除、噬菌體基因組的測(cè)序及原生代的分析、細(xì)胞毒性的有無、最適儲(chǔ)存溫度以及噴劑的穩(wěn)定性等方面的檢驗(yàn),申請(qǐng)到了生產(chǎn)批號(hào),并且應(yīng)用到了燒傷醫(yī)院的臨床上。估計(jì)這樣的噬菌體制劑在不久的將來會(huì)陸續(xù)的被生產(chǎn)出來。

3 對(duì)噬菌體裂解酶進(jìn)行表達(dá)并應(yīng)用于細(xì)菌感染的治療

到目前為止,人們對(duì)裂解酶已經(jīng)做了大量的研究。Raina[25]早在 1981年就對(duì)C群鏈球菌噬菌體的裂解酶進(jìn)行了分離純化,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定。Yokoi等[26]對(duì)瓦氏葡萄球菌前噬菌體的裂解系統(tǒng)(穿孔素-裂解酶)做了一些研究,將表達(dá)穿孔素和裂解酶的基因進(jìn)行了原核表達(dá)及突變分析,并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。Obeso等[27]對(duì)金黃色葡萄球菌噬菌體 ΦH 5的裂解酶進(jìn)行了原核表達(dá),將基因 lysH 5克隆到大腸桿菌內(nèi),表達(dá)產(chǎn)物為 LysH 5。該蛋白具有 3個(gè)結(jié)構(gòu):CHAP(具有作用于半胱氨酸、組氨酸的天門冬酰胺酶/肽酶)、amidase(酰胺酶)、SH 3b(細(xì)胞壁識(shí)別結(jié)構(gòu))。并且將純化后的該蛋白用于牛奶中金黃色葡萄球菌的抑制,效果非常明顯,在 37℃作用 4 h后,就完全檢測(cè)不到該菌。這在當(dāng)時(shí)是首次將噬菌體裂解酶應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中。

Delisle等[28]對(duì)內(nèi)氏放線菌噬菌體Av-1的裂解酶基因進(jìn)行了分離、克隆,并在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)。Gaeng等[29]將李斯特菌噬菌體的裂解酶基因?qū)氲饺樗崛榍蚓羞M(jìn)行了表達(dá)。O'Flaherty[30]等對(duì)一金黃色葡萄球菌噬菌體的裂解酶也在乳酸乳球菌胞內(nèi)進(jìn)行了表達(dá),并測(cè)得表達(dá)產(chǎn)物對(duì)多個(gè)型的金葡菌均具有裂解作用,其中包括MRSA。表明發(fā)酵產(chǎn)生的裂解酶在由金葡菌引起感染的治療中有很重要的應(yīng)用價(jià)值。Celia等[31]對(duì) 1株乳房鏈球菌溫和噬菌體的裂解酶進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,該酶對(duì)多個(gè)型的鏈球菌都有裂解作用,提示該酶在鏈球菌引起的乳房炎的治療中有巨大的潛力。

4 噬菌體及其裂解酶的基因工程改造

現(xiàn)在,基因技術(shù)逐步走向成熟,可以利用基因工程的技術(shù)去解決上面提到的純噬菌體裂解譜窄、不具有較長(zhǎng)的半衰期、裂解活性低等問題?？梢愿鶕?jù)具體的需要,用基因工程的方法改造噬菌體。2007年,Garcia[16]等首先在乳中分離出溫和性噬菌體,經(jīng)過隨機(jī)缺失,使之轉(zhuǎn)化為烈性噬菌體。然后將噬菌體用于乳制品加工過程中金葡菌的控制,收到了良好的效果。Yoichi等[32]針對(duì)不同型大腸桿菌的噬菌體進(jìn)行了同源重組,結(jié)果表明,原來對(duì)一非宿主菌沒有裂解作用的噬菌體,當(dāng)其與這一非宿主菌噬菌體的尾絲發(fā)生了重組后,就具有了裂解這一非宿主菌的能力,同時(shí)失去了裂解原宿主菌的能力。

Westwater等[33]認(rèn)為可以把表達(dá)殺菌蛋白的基因(程序性死亡中的毒素基因)整合到溫和噬菌體上,然后將溫和噬菌體作為一種載體,定向的結(jié)合到宿主菌上并進(jìn)行整合,然后釋放表達(dá)的殺菌蛋白,類似于生物導(dǎo)彈,定向的將目的菌株殺滅。Westwater團(tuán)隊(duì)用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一理論的可行性。

Cheng等[34]對(duì)引起新生幼兒腦膜炎的鏈球菌噬菌體的裂解酶進(jìn)行了人工誘變,在變異基因表達(dá)出來的酶當(dāng)中,有些酶在裂解譜沒有變的情況下,殺菌活性增強(qiáng)了 18～28倍。Briers等[35]對(duì)綠膿桿菌噬菌體ΦKZ的裂解酶KZ144的高親和力區(qū)域進(jìn)行了研究。該區(qū)域是由幾個(gè)模塊兒嵌合組裝起來的。通過改造這個(gè)裂解酶的結(jié)合結(jié)構(gòu),從而增強(qiáng)綠膿桿菌噬菌體編碼的裂解酶的特異性親和力。

5 噬菌體與抗生素的結(jié)合使用

Lu等[36]對(duì)噬菌體進(jìn)行了改造,然后用其與抗生素一起使用,以期能減少細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的產(chǎn)生。經(jīng)過改造的噬菌體的表達(dá)產(chǎn)物可以攻擊細(xì)菌的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),這些都是抗生素不能直接作用的方面,形成了互補(bǔ)。KOHANSKI等[37]的研究表明,抗生素是通過阻止羥基形成,進(jìn)而造成DNA、蛋白質(zhì)、脂類的損傷,最終使細(xì)菌死亡。但 DNA的損傷會(huì)引發(fā)細(xì)胞的 SOS反應(yīng),自動(dòng)對(duì)損傷的 DNA進(jìn)行修復(fù),從而減少致死性的損傷[38,39]。如果能夠敲除recA、抑制SOS反應(yīng),就可以大大增強(qiáng)抗生素的殺菌能力。以前曾經(jīng)報(bào)道過lexA的表達(dá)能夠抑制 SOS反應(yīng),從而能避免耐藥性的產(chǎn)生[40]。M13是非烈性的絲狀噬菌體,它不裂解細(xì)菌,而是將自身的基因整合到宿主菌的DNA上。Little等[41]對(duì)絲狀噬菌體 M13進(jìn)行了改造,使其攜帶lexA3基因,它的表達(dá)產(chǎn)物是SOS反應(yīng)的抑制劑。因此,經(jīng)過改造的噬菌體可以作為抗生素治療細(xì)菌感染的佐劑。

6 展 望

耐萬古霉素腸球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以及多耐藥結(jié)核桿菌等耐藥菌的出現(xiàn),使得噬菌體與裂解酶治療再度引起人們的關(guān)注。目前人們的研究興趣主要集中在應(yīng)用基因工程技術(shù)改造噬菌體及其裂解酶的方面。并且人工改造噬菌體的理論和技術(shù)已趨成熟,噬菌體治療也取得了突破性的進(jìn)展,顯示出了潛在的巨大應(yīng)用前景。廣譜、高效、在機(jī)體內(nèi)具有長(zhǎng)期循環(huán)特性的噬菌體也同樣可以通過人工改造獲得。和抗生素治療一樣,噬菌體治療也存在著細(xì)菌對(duì)噬菌體的耐受問題,對(duì)其耐受機(jī)制的揭曉還有待進(jìn)一步研究。但正如抗生素的使用存在耐藥性的問題并不排斥人類對(duì)抗生素的開發(fā)應(yīng)用一樣,耐受性的問題同樣不排斥噬菌體治療臨床應(yīng)用的可能性。相信隨著研究的不斷深入,噬菌體與其裂解酶應(yīng)用于臨床指日可待,噬菌體的時(shí)代即將到來。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)