溶藻細(xì)菌溶藻活性物質(zhì)的研究進(jìn)展

魏雅冬，王雙俠，戴 明，王廣慧，張騰霄，李 賀

（綏化學(xué)院，黑龍江綏化152061）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴(yán)重。其中最突出的就是含磷工業(yè)廢水大量排放，導(dǎo)致藻類過度繁殖，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象加重，水華和赤潮現(xiàn)象不斷發(fā)生。藻類大量產(chǎn)生會(huì)影響水體的性質(zhì)，還能使水體環(huán)境惡化。進(jìn)入20世紀(jì)以來，我國淡水的水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日益加重，70%的天然淡水湖泊都存在不同程度的富營養(yǎng)化污染現(xiàn)象。因此，去除藻類危害是亟待解決的問題。目前，治理水華和赤潮普遍采用傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法，效果不理想且易造成二次污染。細(xì)菌溶藻得到了廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道較多的是細(xì)菌分泌胞外物質(zhì)到環(huán)境中抑制藻的生長，導(dǎo)致藻細(xì)胞溶解[1]。因此通過篩選溶藻細(xì)菌來提取其溶藻活性物質(zhì)成為一個(gè)新的研究思路。溶藻細(xì)菌的研究在國外已有數(shù)十年歷史，最早(1924)發(fā)現(xiàn)的溶藻細(xì)菌是粘細(xì)菌屬(Myxobacter)，隨后國內(nèi)外一些文獻(xiàn)又有報(bào)道如中性檸檬酸菌 (Cltrobacter intermedius)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)等對(duì)眾多藻類均有一定的抑制、溶解、毒害或殺傷作用[2]。目前，國內(nèi)在溶藻細(xì)菌及其溶藻活性物質(zhì)方面的研究剛剛起步。在微生物中細(xì)菌的數(shù)量占大多數(shù)，而且分離研究也比較容易，因此溶藻細(xì)菌在治理水體富營養(yǎng)化方面會(huì)有廣闊的發(fā)展前景。

1 溶藻細(xì)菌溶藻活性物質(zhì)的作用方式

溶藻細(xì)菌是指通過直接或間接方式，抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細(xì)胞的細(xì)菌的統(tǒng)稱[3]。溶藻細(xì)菌對(duì)藻細(xì)胞的作用方式主要有兩種：一是直接溶藻，即細(xì)菌與藻細(xì)胞直接接觸或侵入藻細(xì)胞使之遭到破壞；二是間接殺藻，主要體現(xiàn)在細(xì)菌分泌特殊活性物質(zhì)抑制藻類生長。后者被認(rèn)為是細(xì)菌溶藻的主要方式。對(duì)溶藻細(xì)菌作用方式的研究一方面可以知道其作用機(jī)理，另外還能對(duì)生物殺藻劑的研制有理論指導(dǎo)作用。

2 溶藻細(xì)菌溶藻活性物質(zhì)的種類

溶藻細(xì)菌可以通過釋放特異性或非特異性胞外物質(zhì)，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、抗生素和羥胺等殺死藻細(xì)胞。這類細(xì)菌常見的有粘細(xì)菌（Myxobacter）、弧菌（Vibrio）、假單胞菌（Pseudomonas）、黃桿菌（Flavobacterium）、交替單胞菌（Alteromonas）等。目前報(bào)道的細(xì)菌溶藻物質(zhì)主要有以下幾類：

2.1 氨基酸

Yoshikawa[4]從日本一些島采集水樣，篩選具有抗藍(lán)藻（Cyanobacteria）活性的細(xì)菌。共篩選出2594株細(xì)菌，其中僅有37株能分泌抗藍(lán)藻（Cyanobacteria）的活性物質(zhì)。其中一株被鑒定為弧菌（Vibrio）。為進(jìn)一步驗(yàn)證其產(chǎn)生的活性物質(zhì)，將其在海洋肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明：該弧菌（Vibrio）產(chǎn)生的活性物質(zhì)為β-氰基-L-丙氨酸（L-CNAIa），對(duì)細(xì)菌和真菌的生長沒有影響，但一定濃度的該物質(zhì)會(huì)影響某些藍(lán)藻（Cyanobacteria）的生長。化合物β-氰基-L-丙氨酸（L-CNAIa）可能是影響海洋藻類種群動(dòng)力學(xué)的一個(gè)重要因素。

2.2 多肽

Imamura[5]從Biwa湖含微囊藻的水樣中分離出一株鞘氨醇單胞菌（Sporobolomyces），該鞘氨醇單胞菌（Sporobolomyces）釋放的溶藻物質(zhì)對(duì)微囊藻（Microcystis）有強(qiáng)烈殺滅作用。經(jīng)鑒定，該溶藻物質(zhì)為五肽argimicinA，分子式為 C32H6N12O8。它在12ug/mL和100ug/mL濃度時(shí)分別對(duì)綠色微囊藻（Microcystis stiviridsi）和銅綠微囊藻（Microcystis areuginosa）有很強(qiáng)的溶藻活性，對(duì)直接從水體中分離的含有細(xì)菌的藍(lán)藻（Cyanobacteria）亦有很強(qiáng)的溶藻效果。Banin[6]報(bào)道了一株珊瑚褪色弧菌（Vibrio shiloi），該菌能合成并分泌一種胞外多肽，被稱為毒素P，該毒素能夠抑制與珊瑚共生的蟲黃藻的光合作用，導(dǎo)致蟲黃藻死亡。

2.3 蛋白質(zhì)

Lee[7]從海水中分離一株編號(hào)為A28的假交替單胞菌（Pesudoaletormonas）。試驗(yàn)結(jié)果表明：該菌能殺滅骨條藻（Skeletonema costatum）。將A28培養(yǎng)一段時(shí)間后，取其上清液作溶藻實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該上清液有很強(qiáng)的殺藻能力。上清液經(jīng)過高溫處理，結(jié)果A28的上清液沒有表現(xiàn)出殺藻活性。進(jìn)一步試驗(yàn)檢測(cè)表明A28能產(chǎn)生一種胞外絲氨酸蛋白酶殺藻。

Mitsutani[8]報(bào)道一株編號(hào)為A25的假交替單胞菌（Pesudoaletormonas），用一定濃度的該菌液接種到骨條藻（Skeletonema costatum）培養(yǎng)物中后，2天內(nèi)就能把骨條藻（Skeletonema costatum）全部溶解。雙向電泳對(duì)A25蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明：A25在菌體生長穩(wěn)定期能產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)，而在穩(wěn)定期以后的各時(shí)期未檢測(cè)到活性物質(zhì)。把穩(wěn)定期菌體進(jìn)行離心，仍然表現(xiàn)出溶藻能力。這些試驗(yàn)結(jié)果表明：A25是通過穩(wěn)定期分泌的蛋白質(zhì)活性物質(zhì)來溶解骨條藻（Skeletonema costatum）的。

2.4 抗生素

Dakhama[9]發(fā)現(xiàn)一株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌能釋放低分子量并具有熱抗性的物質(zhì)。在試驗(yàn)的藻類中，該菌能強(qiáng)烈抑制藍(lán)藻（Cyanobacteria）和綠藻（Chlorophyta）的生長。進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果表明：這株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是通過釋放瓊脂擴(kuò)散性嗪色素抑制宿主藻類的生長。

2.5 羥胺

Paul[10]分離出一株節(jié)桿菌（Arthorbacetsrp），屬于硝化細(xì)菌。試驗(yàn)結(jié)果表明：該菌的分泌物能強(qiáng)烈抑制小球藻（Chlorella vulgaris）的生長。進(jìn)一步試驗(yàn)表明：該菌是通過氧化銨或其它還原性的氮化合物釋放的羥胺抑制小球藻（Chlorella vulgaris）的生長。

2.6 其它溶藻細(xì)菌的活性物質(zhì)

近年來，隨著對(duì)溶藻細(xì)菌研究的不斷深入，溶藻細(xì)菌的溶藻活性物質(zhì)不斷被報(bào)道。多數(shù)學(xué)者報(bào)道的都是溶藻細(xì)菌通過分泌胞外物質(zhì)對(duì)宿主藻細(xì)胞起到抑制或殺滅的作用。Lovejoy[11]發(fā)現(xiàn)一株假交替單胞菌（Pesudoaletormonas）分泌細(xì)胞外物質(zhì)溶藻。Baker[12]發(fā)現(xiàn)某種假單胞菌（Pseudomonas）能夠分泌活性物質(zhì)殺滅硅藻（Thalassiosira pseudonana），這種物質(zhì)分子量大且對(duì)熱不穩(wěn)定。裴海燕等[13]分離出一株芽抱桿菌（Bacillus），該菌通過釋放溶藻物質(zhì)溶藻。該溶藻物質(zhì)耐熱性較好。目前，多數(shù)溶藻細(xì)菌的活性物質(zhì)沒有被鑒定，所以它們的作用機(jī)制也不是很清楚。

3 溶藻細(xì)菌溶藻活性物質(zhì)的提取和篩選方法

通常情況下，溶藻細(xì)菌活性物質(zhì)的提取是通過檢測(cè)培養(yǎng)菌上清液是否具有溶藻活性的方法進(jìn)行的。即首先通過常規(guī)平板法分離篩選細(xì)菌，然后用被篩選溶藻細(xì)菌培養(yǎng)物上清液進(jìn)行溶藻試驗(yàn)，若該上清液有溶藻能力，這就表明該細(xì)菌是通過分泌活性物質(zhì)進(jìn)行溶藻的。最后再通過理化方法以及分子生物學(xué)手段對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)一步鑒定，進(jìn)而對(duì)活性物質(zhì)作分類，但是這種方法效率比較低。Yoshikawa[4]為了檢驗(yàn)其所分離細(xì)菌的分泌物是否具有溶藻活性，從供試的2594株分離細(xì)菌中僅發(fā)現(xiàn)37種能產(chǎn)生抗顫藻（Oscillatoria）的物質(zhì)。這種方法屬于隨機(jī)篩選，不僅勞動(dòng)量大，且試驗(yàn)周期也較長。為了提高篩選效率，Imamura[2]采用了一種兩步篩選法來篩選抗微囊藻（Microcystis）化合物的效率。首先將通過藻菌液體共同培養(yǎng)篩選出溶藻細(xì)菌，然后用無水乙醇提取溶藻細(xì)菌的培養(yǎng)物，待培養(yǎng)物室溫干燥后，將其與微囊藻（Microcystis）共培養(yǎng)，從中篩選分泌殺微囊藻（Microcystis）物質(zhì)的菌株，最后從這些菌株中分離和鑒定殺藻物質(zhì)。這種方法在很大程度上提高了細(xì)菌殺藻物質(zhì)的篩選效率。

因細(xì)菌溶藻活性物質(zhì)種類較多，特性也有差異，雖然現(xiàn)在也逐步采用分子生物學(xué)手段，但仍然有多數(shù)溶藻活性物質(zhì)未被純化和鑒定，這就限制了對(duì)其溶藻機(jī)理的進(jìn)一步研究。鑒于此，這就需要人們掌握一定的先進(jìn)方法和技術(shù)手段。

4 溶藻細(xì)菌溶藻活性物質(zhì)的研究展望

溶藻細(xì)菌的溶藻活性物質(zhì)作為開發(fā)新型生物殺藻劑的一種新思路，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，如何提取、純化和鑒定高效并具有特異性的溶藻活性物質(zhì)是目前研究的重點(diǎn)。而如何提高溶藻細(xì)菌的篩選效率和對(duì)溶藻活性物質(zhì)分子生物學(xué)方面的研究將是未來一段時(shí)間內(nèi)要研究的熱點(diǎn)。而采用基因工程手段來構(gòu)建新型菌株將是溶藻細(xì)菌研究領(lǐng)域中最具意義的研究課題。

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