尼古丁降解菌的分離鑒定和初步特性研究

江吉紅，商弘穎，吳立飛，陳連升，馬 云

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

尼古丁降解菌的分離鑒定和初步特性研究

江吉紅，商弘穎，吳立飛，陳連升，馬 云

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

從浙江省某農(nóng)藥廠的活性污泥中分離得到一株尼古丁高效降解細(xì)菌，根據(jù)表型特征、生理生化特性和16S r DNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為假單胞菌屬，命名為TW5.該菌株能以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長(zhǎng)，當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌株TW5在含500 mg／L尼古丁的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中降解尼古丁，12 h后降解率約為100%.該菌株降解尼古丁的最適pH為6.5～7.0，最適溫度為30℃.研究表明，該菌株具有很強(qiáng)的尼古丁降解能力，可用于處理含尼古丁廢棄物.

尼古??；降解；生物特性；假單胞菌

尼古?。╪icotine），俗稱煙堿，分子式為C10H14N2，是多種煙草中所特有的、最重要的生物堿，占煙草重量的1%～2%，是影響煙葉品質(zhì)的重要因素之一，同時(shí)也是煙葉和卷煙的主要有害成分之一.

尼古丁是一種精神藥品，人類長(zhǎng)期保持著吸食煙草的習(xí)慣.然而，尼古丁是煙葉和煙氣中主要致癌成分N-亞硝胺（TSNA）的重要前體物［1］，過(guò)量吸入會(huì)抑制人體中樞神經(jīng)，麻痹心臟，嚴(yán)重者會(huì)有致命的危險(xiǎn)［2］；尼古丁也是一種環(huán)境有毒物質(zhì)，在常溫下，純凈的尼古丁是無(wú)色或淡黃色、味苦、有強(qiáng)烈刺激性的透明的油狀液體，在空氣中極易被氧化成暗灰色.煙氣環(huán)境中就含有大量的尼古丁，目前在我國(guó)的煙葉中尤其是在上部煙葉中尼古丁的含量普遍過(guò)高，這給煙葉的安全生產(chǎn)帶來(lái)很大的挑戰(zhàn).同時(shí)，煙草在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的高濃度尼古丁廢料，這種廢料被認(rèn)為是“有毒的危險(xiǎn)廢物”［3］，若直接排放到環(huán)境中，則對(duì)環(huán)境造成很大的危害.因此使得不斷控制和降低卷煙尼古丁含量成為國(guó)際煙草業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)，同時(shí)也是降低吸煙危害的重要途徑之一，這對(duì)于維護(hù)人類健康有著深遠(yuǎn)的意義.

較之物理、化學(xué)的方法去除烤煙中的尼古丁，微生物法具有操作簡(jiǎn)單、易改造等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注.早在20世紀(jì)40年代，就已經(jīng)有關(guān)于微生物降解尼古丁的報(bào)道.目前國(guó)內(nèi)外的研究者已經(jīng)分離得到多株尼古丁降解菌，主要有：假單胞菌屬［4－7］、節(jié) 桿 菌 屬［8］、纖 維 單 胞 菌 屬［9］、蒼 白 桿 菌屬［10］、芽孢桿菌屬［11］等.這些微生物多數(shù)能利用尼古丁為唯一碳源、氮源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，它們主要通過(guò)吡啶途徑［8－12］、吡咯途徑［13－14］、脫甲基化途徑［15－16］將尼古丁轉(zhuǎn)化為羧酸和氨基酸，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源、氮源和能源，從而達(dá)到降解有毒廢物的目的.

本研究中從杭州農(nóng)藥廠分離篩選得到一株尼古丁高效降解菌，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定和降解特性的研究，發(fā)現(xiàn)該菌株可能存在全新的降解途徑，這為更全方面的了解尼古丁的降解途徑提供了依據(jù)，也為構(gòu)建具有更高降解效率和能耐受更高尼古丁濃度的工程菌建立了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富集用的活性污泥采自杭州農(nóng)藥廠.

基礎(chǔ) 鹽 培 養(yǎng) 基 （MM）：NH4NO31.0 g／L，K2HPO41.5 g／L，KH2PO40.5 g／L，MgSO40.2 g／L，NaCl 1.0 g／L，加入自行配置的微量元素溶液1 mL，pH 7.0.

基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加入1.5%～2%的瓊脂粉.

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g／L，酵母膏5.0 g／L，NaCl 10.0 g／L.

固體LB培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入1.5%～2%的瓊脂粉.

以上培養(yǎng)基與緩沖液均經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌（121℃，25 min）.

尼古丁原藥購(gòu)自伊普瑞斯（純度為99%），使用前將尼古丁原藥溶于無(wú)菌水中，按所需濃度添加到培養(yǎng)基中.

抗生素購(gòu)自上海捷倍思公司；PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 尼古丁降解菌的分離與純化

取上述活性污泥5 g放于100 mL的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，其中基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中尼古丁的質(zhì)量濃度為500 mg／L，30℃，150 r／min搖床培養(yǎng)7 d后，以5%接種量轉(zhuǎn)接至新的含尼古丁的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接5次，尼古丁的濃度逐漸提高到1 000 mg／L.取富集后的培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后（10－3，10－4，10－5，10－6）涂布于含1 000 mg／L的尼古丁基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng).待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取單菌落劃線于LB固體培養(yǎng)基中，反復(fù)劃線進(jìn)行純化，將純化后的菌落接種至LB固體斜面培養(yǎng)基中保存.

1.2.2 菌種的鑒定

16S r DNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析：采用細(xì)菌16S r DNA的通用引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司合成），其正向引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′，反向引物序列為：5′-CGGCTACCTTGTTACGACTTC23′［17］進(jìn) 行 16S r DNA 的 PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由上海英俊公司完成.測(cè)序結(jié)果利用Blast在GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比較和鑒定.將16S r DNA序列和與其同源性高的序列用DNASTARver.7.1.0中的 multiple sequence alignment software CLUSTAL W分析，并用Megalign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.2.3 尼古丁降解實(shí)驗(yàn)

（1）檢測(cè)方法

尼古丁殘留量的檢測(cè)：本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法檢測(cè)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中尼古丁的殘留量.降解液經(jīng)過(guò)離心后（10 000 r／min，10 min，4℃），于4℃保存?zhèn)溆?高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)條件：流動(dòng)相為V（CH3OH）∶V（H2O）＝10∶90，其中水中含有1 m M H2SO4，分析柱為Grace Alltima C18 Column（4.6 mm×250 mm，5μm），流速為0.6 mL／min，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為30℃.

生物量的檢測(cè)：2 mL培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)離心（10 000 r／min，10 min，4℃）獲得菌體，用2 mL的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基洗滌3次，然后用2 mL相同的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基重新懸浮，在600 nm處測(cè)定其OD值（紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)JASCO V-550型）.

（2）培養(yǎng)條件對(duì)降解菌生長(zhǎng)和降解能力的影響

尼古丁起始質(zhì)量濃度的影響：將培養(yǎng)16 h的菌體（5 mL菌液離心所得）接種到100 mL不同尼古丁起始濃度（200，500，1 500，4 000 mg／L）的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)（150 r／min，30℃）.連續(xù)測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)和尼古丁的降解情況.

培養(yǎng)溫度的影響：將培養(yǎng)16 h的菌體（5 mL菌液離心所得）接種到100 mL含尼古丁（500 mg／L）的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，在150 r／min和不同溫度（23，30，37，45℃）下培養(yǎng)，連續(xù)測(cè)定尼古丁的降解情況.

起始pH的影響：將培養(yǎng)16 h的菌體（5 mL菌液離心所得）接種到100 mL含尼古?。?00 mg／L）的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，在不同起始pH（5.5，6.0，6.5，7.0，8.0，9.0），150 r／min，30 ℃條件下培養(yǎng)12 h，測(cè)定尼古丁的降解情況.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的鑒定

形態(tài)及生理生化特征：選擇在含尼古丁的基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)最好的一株作為研究對(duì)象，命名為TW5.菌株TW5在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d后，菌落邊緣擴(kuò)散，呈淡黃色，表面光滑，濕潤(rùn)，不透明.能利用葡萄糖、淀粉、吐溫40為唯一碳源，不能利用β－環(huán)糊精、乙酸鈉.甲基紅試驗(yàn)（M.R）、過(guò)氧化氫酶為陽(yáng)性，V P、氧化酶為陰性.菌株對(duì)氨芐具有抗性，而對(duì)氯霉素、卡那霉素和鏈霉素均沒(méi)抗性.

16S r DNA序列分析：根據(jù)16S r DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1），序列同源性分析表明，確定菌株TW5為Pseudomonas sp.

圖1 菌株TW5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree by strain TW5

2.2 不同條件下尼古丁降解實(shí)驗(yàn)

用（OD）600值和尼古丁殘留量表示菌株TW5生長(zhǎng)和降解尼古丁的情況.

尼古丁初始濃度對(duì)菌株TW5的生長(zhǎng)和降解影響分別如圖2，3所示，從圖2中我們可以看出菌株TW5在尼古丁質(zhì)量濃度為200～1 500 mg／L的濃度范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)良好，并且延滯期較短，從圖3中我們可以看出菌株TW5在9 h內(nèi)對(duì)質(zhì)量濃度為200 mg／L和500 mg／L的尼古丁的降解率接近100%，對(duì)于質(zhì)量濃度為1 500 mg／L的尼古丁，12 h內(nèi)的降解效率能達(dá)70%以上，24 h能將其降解接近完全.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)尼古丁質(zhì)量濃度為4 000 mg／L時(shí)，菌株TW5仍能生長(zhǎng)，而且菌株TW5能以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長(zhǎng)，是尼古丁的高效降解菌，對(duì)處理高濃度的尼古丁廢水有非常好的效果，可用于尼古丁廢水的集中修復(fù).

溫度對(duì)菌株TW5降解尼古丁的影響如圖4所示，結(jié)果顯示溫度對(duì)TW5降解尼古丁的影響較大，菌株TW5在30℃以前，隨著溫度的升高，降解效率增大，當(dāng)超過(guò)37℃時(shí)，降解率快速下降；降解的最適溫度為30℃.

不同初始PH值對(duì)菌株降解尼古丁的影響如圖5所示，結(jié)果顯示尼古丁的降解在pH 9.0時(shí)最差；pH 6.5～7.0之間較好，降解率都達(dá)到95%以上；降解的最適pH為6.5～7.0.

圖5 不同初始pH值對(duì)TW5降解尼古丁的影響Fig.5 Effect of pH on nicotine degrade by strain TW5

通過(guò)上述圖表分析可知菌株TW5降解尼古丁的最佳條件為30℃，pH 6.5～7.0.經(jīng)過(guò)12 h的培養(yǎng)，菌株對(duì)質(zhì)量濃度為500 mg／L的尼古丁的降解效率接近100%，24 h內(nèi)能將質(zhì)量濃度為1 500 mg／L的尼古丁降解接近完全，最高耐受尼古丁的濃度為4 000 mg／L.目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于尼古丁的降解途徑主要集中在吡咯途徑、吡啶途徑和脫甲基途徑方面，而用菌株TW5在加有尼古丁的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液的顏色會(huì)由無(wú)色慢慢變?yōu)榫G色，最后變?yōu)榫萍t色，這顯然與我們已知的尼古丁降解途徑存在著差別，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的菌株在降解尼古丁的過(guò)程中具有這種顏色變化的非常少，對(duì)這種綠色的產(chǎn)物以及其代謝途徑的研究也是非常少，菌株TW5中有可能存在著新的尼古丁降解途徑，這有待于以后的深入研究.

3 結(jié) 論

從浙江省某農(nóng)藥廠活性污泥中篩到一株能以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源的生長(zhǎng)的假單胞屬的菌株TW5，其降解尼古丁的最佳條件是30℃，pH為6.5～7.0，最高耐受尼古丁的濃度為4 000 mg／L.菌株TW5在降解尼古丁的過(guò)程中溶液顏色有綠色和酒紅色產(chǎn)生，推測(cè)菌株TW5在降解尼古丁的過(guò)程中產(chǎn)生了綠色的代謝產(chǎn)物，有可能存在全新的尼古丁降解途徑，這對(duì)研究尼古丁的降解途徑有著非常重要的意義.

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Isolation and characterization of a nicotine-degrading bacterium

JIANG Ji-hong，SHANG Hong－ying，WU Li-fei，CHEN Lian-sheng，MA Yun
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhengjiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

A strain of bacterium designated as Strain TW5，capable of degrading nicotine efficiently，was isolated from sludge in a Hangzhou pesticide factory，Zhejiang province.Strain TW5 was identified preliminarily as Pseudomonas sp.based on its physiological and biochemical characters and the result of the 16S r DNA homologue sequence analysis.This bacterium could degrade approximately 100%of 500 mg／L nicotine in 12 h.Results of its degradation characteristics showed that the optimal pH and temperature for nicotine degradation were 6.5～7.0 and 30℃，respectively.TW5 showed high ability to degrade nicotine and has a potential strain for direct application in contain nicotine waste treatment.

nicotine；degradation；biological characteristics；Pseudomonas

X172

A

1006-4303（2011）06-0614-05

2010-09-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21007058）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y5100253）

江吉紅（1985—），女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物研究，E-mail：jiang044189＠sina.com。通信作者：馬云副教授，E-mail：mayun＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）