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      eNOS與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的關(guān)系

      2011-08-25 03:57:00王燈亮康德智張?jiān)?/span>林章雅林元相余良宏
      關(guān)鍵詞:蛛網(wǎng)膜下腔腦血管

      王燈亮, 康德智, 張?jiān)。?林章雅, 林元相, 余良宏

      蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)主要是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血引起,并出現(xiàn)不同程度的腦血管痙攣(cerebral vasospasm CVS),是引起高致殘率、致死率的主要原因之一。雖然對(duì)SAH后血管痙攣的機(jī)制研究較多,有學(xué)者報(bào)道稱多因子機(jī)制參與了腦血管痙攣的發(fā)生[1],但目前其具體發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚。

      NO是一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化產(chǎn)物,作為一種氣體,NO不容易直接測(cè)量,因此,常通過(guò)對(duì)NOS的研究來(lái)間接反應(yīng)NO生物學(xué)作用。根據(jù)組織來(lái)源可將NOS分為內(nèi)皮型(eNOS)、神經(jīng)元型(nNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。近來(lái)有研究顯示eNOS功能紊亂可能參與腦血管痙攣的發(fā)展[2]。

      本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兔枕大池二次注血法建立SAH后CVS的模型,運(yùn)用Western blotting觀察在SAH后不同時(shí)間點(diǎn)eNOS表達(dá)的變化,旨在探討eNOS與SAH后腦血管痙攣的關(guān)系,從而進(jìn)一步有助于臨床上的診斷和治療。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 研究對(duì)象為72只新西蘭大白兔由上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供許可證號(hào) SCXK(滬)2007-0007,雌雄不限,體重為2.0~2.8kg,自由進(jìn)食,晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。主要實(shí)驗(yàn)試劑為eNOS多克隆抗體(武漢伊艾博科技有限公司提供)等。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 成年新西蘭大白兔72只,隨機(jī)分成以下兩組:(1)對(duì)照組(12只),枕大池注入生理鹽水;(2)SAH組(60只),按時(shí)間隨機(jī)分為術(shù)后 1d、3d、5d、7d、10d 5 個(gè)亞組,每組 12 只,經(jīng)手術(shù)于枕大池注入兔自體耳中央動(dòng)脈血。

      1.2.2 兔SAH模型的制作 采用枕大池二次注血方法建立穩(wěn)定的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。以鹽酸氯氨酮30mg/kg和氯丙嗪7.5mg/kg肌肉注射進(jìn)行麻醉。枕部剃毛,俯臥位固定,消毒后于枕部中線作一直切口,長(zhǎng)2.5cm,鈍性分離直達(dá)寰枕筋膜,2ml注射器針頭經(jīng)皮穿刺枕大池,此時(shí)可見(jiàn)清亮腦脊液流出,按照0.4ml/kg放出腦脊液后,立即從兔耳中央動(dòng)脈抽取等量非抗凝動(dòng)脈血緩慢注入枕大池中。首次注血0.4ml/kg,48h后重復(fù)上述操作,注入動(dòng)脈血0.2ml/kg。二次注血24h后為SAH后第1天,依次類推。對(duì)照組在放完腦脊液后注入等量生理鹽水,余操作同實(shí)驗(yàn)組。

      1.2.3 活體灌注 予鹽酸氯氨酮30mg/kg和氯丙嗪7.5mg/kg肌肉注射對(duì)兔進(jìn)行麻醉。打開胸腔,剝開心包膜,將下腔靜脈和腹主動(dòng)脈用動(dòng)脈夾夾閉,剪開右心耳放出血液,再剪開左心室將灌注頭插入主動(dòng)脈然后用動(dòng)脈夾固定。行HE染色檢查的兔子先輸入500ml生理鹽水將血管內(nèi)的血沖洗凈,再注入500ml的多聚甲醛固定液固定。行石蠟包埋后備做檢查。行 Western blotting檢測(cè)的兔子灌入500ml 4℃預(yù)冷生理鹽水,灌注后取出腦組織和基底動(dòng)脈,之后將基底動(dòng)脈分離出來(lái),置于凍存管中,放入液氮灌中速凍后轉(zhuǎn)入-80℃長(zhǎng)期保存。

      1.2.4 標(biāo)本制作及組織學(xué)評(píng)價(jià) 經(jīng)甲醛固定的腦及血管組織石蠟包埋,在每個(gè)基底動(dòng)脈的近、中、遠(yuǎn)段的中點(diǎn)取材,每點(diǎn)連續(xù)取1個(gè)切片,層厚4μm,切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色后,采用 Leica DM2500顯微鏡以及Image-Pro Plus(Version 5.1)圖像分析軟件測(cè)定每個(gè)切片中血管標(biāo)本的橫截面積,計(jì)算3張切片平均橫截面積,作為該兔的基底動(dòng)脈管腔面積。

      1.2.5 Western blotting檢測(cè)eNOS表達(dá) 收集對(duì)照組、各實(shí)驗(yàn)組基底動(dòng)脈標(biāo)本,使用哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑(RIPA)進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取,應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白含量。每個(gè)樣品槽內(nèi)10μl樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳,通過(guò)電轉(zhuǎn)印法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移NC膜上,轉(zhuǎn)印后的NC膜用5%脫脂奶粉室溫輕搖30min后加入一抗(濃度1∶500),室溫輕搖30min后放于4℃過(guò)夜,TBS洗膜后加入濃度為1∶2000的二抗(羊抗兔),室溫輕搖40min,TBS洗膜,ECL顯色液顯色,拍照。

      2 結(jié)果

      2.1 大體標(biāo)本觀察 對(duì)照組腦干腹側(cè)基底動(dòng)脈周圍無(wú)血凝塊,實(shí)驗(yàn)組在1d、3d、5d、7d標(biāo)本基底動(dòng)脈周圍可見(jiàn)明顯的凝血塊,隨時(shí)間的推移,凝血塊的范圍、大小和顏色呈現(xiàn)減退,至第10天,基底動(dòng)脈周圍凝血塊已經(jīng)基本消失(見(jiàn)圖1、圖2)。

      2.2 各組基底動(dòng)脈橫截面積比較 基底動(dòng)脈行HE染色后,測(cè)定每個(gè)切片中血管標(biāo)本的橫截面積,取得各個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的基底動(dòng)脈橫截面積。對(duì)照組基底動(dòng)脈橫截面積為584971.4±80780.1 μm2,SAH 第 1 天為 329441.5 ±15907.5μm2;SAH第3天為 404492.3±73172.1μm2;SAH 第 5 天為300619.6 ±26176.2μm2;SAH 第7 天為242604.7 ±45977.1μm2;SAH 第 10 天為 362157.4 ±38480.7。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組基底動(dòng)脈橫截面積總體小于對(duì)照組,與對(duì)照組比較有差異(P<0.05),SAH第3天、第7天和第10天相比,P<0.05。

      2.3 基底動(dòng)脈組織學(xué)變化 在光鏡下,對(duì)照組的血管壁無(wú)增厚,內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,內(nèi)彈力膜清晰可見(jiàn),結(jié)構(gòu)完整。SAH模型組可見(jiàn)血管壁增厚,管腔狹窄,內(nèi)皮細(xì)胞變性、腫脹,染色質(zhì)不均,空泡形成;內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂,厚薄不均,平滑肌細(xì)胞排列紊亂。這些改變?cè)赟AH后第1天開始出現(xiàn),第3天逐漸明顯,第5天和第7天表現(xiàn)最為明顯,第10天上述改變明顯減輕,內(nèi)彈力膜皺縮基本消失,內(nèi)皮細(xì)胞排列漸趨平整,內(nèi)皮細(xì)胞稍有腫脹,管徑基本恢復(fù)正常(見(jiàn)圖3、圖4)。

      2.4 各組兔基底動(dòng)脈eNOS表達(dá)情況 Western blotting觀察到eNOS在對(duì)照組大量表達(dá),對(duì)照組為1.957322 ±0.028485,SAH 第 1 天為 1.833437 ±0.036424;SAH 第 3 天為 1.389229 ±0.072982;SAH第5天為 1.161714±0.030655;SAH 第 7 天為1.239918±0.027786;SAH 第 10 天為 1.434776 ±0.067526。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組第1天表達(dá)開始減少,第5天表達(dá)水平明顯減弱,之后表達(dá)逐漸增加,與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖5、圖6)。

      圖1 對(duì)照組腦干周圍未見(jiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血

      圖2 SAH組第5天腦干周圍大量蛛網(wǎng)膜下腔出血

      圖3 對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,內(nèi)彈力膜清晰可見(jiàn),結(jié)構(gòu)完整

      圖4 SAH組注血后第5天內(nèi)皮細(xì)胞變性、腫脹,染色質(zhì)不均空泡形成;內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂

      圖5 各組eNOS表達(dá)情況 注:與對(duì)照組比較*P<0.05

      圖6 各組eNOS檢測(cè)結(jié)果

      3 討論

      蛛網(wǎng)膜下腔出血后約30%~50%患者會(huì)出現(xiàn)腦血管痙攣,可導(dǎo)致腦缺血、引起神經(jīng)功能障礙、甚至死亡[3]。腦血管痙攣呈雙相性,一種為早發(fā)性,多見(jiàn)于SAH后0.5h~3d,常于4h內(nèi)緩解,也稱急性腦血管痙攣;另一種為遲發(fā)性腦血管痙攣(DCVS),發(fā)生于出血后4~15d,7~10d為高峰期,2~4w逐漸減少。遲發(fā)性腦血管痙攣不同于急性期腦血管痙攣,其一旦發(fā)生,難于逆轉(zhuǎn),后果往往較嚴(yán)重[4]。然而,關(guān)于腦血管痙攣的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,至今尚未完全闡明。目前普遍認(rèn)為SAH后CVS是由多因素所致,如高分子溶血產(chǎn)物氧合血紅蛋白(OxyHb)的增多、擴(kuò)血管物質(zhì)如NO減少、細(xì)胞凋亡、血液高凝狀態(tài)、免疫炎癥反應(yīng)[5]等因素。

      本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后第1天eNOS表達(dá)開始減少,第5天減少最嚴(yán)重,之后開始慢慢恢復(fù)。HE染色提示SAH后第1天開始出現(xiàn)血管壁增厚,管腔狹窄,內(nèi)皮細(xì)胞變性、腫脹,染色質(zhì)不均,空泡形成;內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂,厚薄不均,平滑肌細(xì)胞排列紊亂;第3天逐漸明顯;第5天和第7天表現(xiàn)最為明顯;第10天上述改變明顯減輕。eNOS的表達(dá)與血管壁的病理改變相符。我們認(rèn)為eNOS與腦血管痙攣可能存在一定的關(guān)系,其表達(dá)減少可能參與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)展。

      eNOS是NO/cGMP信號(hào)途徑的關(guān)鍵酶,通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子和鈣調(diào)蛋白相偶聯(lián)而激活,具有調(diào)節(jié)血管緊張度和保持內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用,可能還有神經(jīng)保護(hù)和抗炎癥作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS催化產(chǎn)生NO釋放后,能迅速進(jìn)入鄰近的平滑肌細(xì)胞,激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(GC),GC催化產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸(cGMP),cGMP激活細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)上鈣泵,使細(xì)胞內(nèi)游離鈣泵入肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi),細(xì)胞內(nèi)游離鈣減少,使血管平滑肌處于舒張狀態(tài)[6]。同時(shí)cGMP可通過(guò)抑制蛋白激酶活性,使血管平滑肌舒張。蛛網(wǎng)膜下腔出血后,NO水平下降,則GC活性降低,cGMP生成不足,從而舒張平滑肌能力減弱。eNOS可能通過(guò)解偶聯(lián)作用導(dǎo)致SAH后繼發(fā)腦血管痙攣、微血栓形成,甚至導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡[7]。

      eNOS合成的NO作為血管調(diào)節(jié)因子的同時(shí),還具有維持血管壁幾何形態(tài)的作用,對(duì)血管性疾病起到預(yù)防作用。研究表明,在eNOS基因敲除的大鼠模型中,由于eNOS缺乏可以導(dǎo)致血管壁囊性膨出,提示eNOS合成的NO作為血管舒張因子的同時(shí),還可以起到維持血管壁結(jié)構(gòu)的作用[8]。SAH時(shí)由于血管內(nèi)皮細(xì)胞在毒性作用下結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,使eNOS活性降低,NO的合成減少,NO含量下降,可造成血管痙攣。有學(xué)者指出,eNOS基因多態(tài)性可以預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦血管痙攣的易感性[9,10]。Pyne-Geithman 等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) eNOS 是預(yù)測(cè)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的有用指標(biāo)[11]。許多藥物可能通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS的表達(dá)而發(fā)揮減輕腦血管痙攣的作用:雌二醇可能通過(guò)保持eNOS的表達(dá)水平而發(fā)揮減輕腦血管痙攣的作用[12];川芎嗪毛冬青(毛披樹)可能通過(guò)上調(diào)eNOS的表達(dá)水平增加NO表達(dá)水平從而減輕腦血管痙攣[13];辛伐他汀通過(guò)上調(diào)eNOS的磷酸化水平而發(fā)揮減輕腦血管痙攣?zhàn)饔茫?4]。

      綜上所述,eNOS是合成NO的關(guān)鍵酶,SAH后痙攣的腦血管壁中eNOS減少,從而進(jìn)一步證明了NO減少在血管痙攣的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。繼續(xù)加深對(duì)eNOS的研究可能有利于指導(dǎo)臨床腦血管痙攣的防治。

      [1] Guresir E,Raabe A,Jaiimsin A,et al.Histological evidence of delayed ischemic brain tissue damage in the rat double-hemorrhage model[J].JNeurol Sci,2010,293(1 ~2):18 - 22.

      [2] Osuka K,Watanabe Y,Usuda N,et al.Modification of endothelial nitric oxide synthase through AMPK after experimental subarachnoid hemorrhage[J].JNeurotrauma,2009,26(7):1157 -1165.

      [3] Pyne-Geithman GJ,Caudell DN,Cooper M,et al.Dopamine D2-receptor-mediated increase in vascular and endothelial NOS activity ameliorates cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in vitro[J].Neurocrit Care,2009,10(2):225 - 231.

      [4] 陳新軍,袁先厚,江普查,等.蛛網(wǎng)膜下腔出血血漿一氧化氮、一氧化氮合酶含量及其臨床意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,30(6):497-498.

      [5] 張 健,王 中,周 岱,等.NF-κB、ICAM-1在實(shí)驗(yàn)性SAH后基底動(dòng)脈壁上的表達(dá)變化[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2009,26(6):684-688.

      [6] Murad F.Nitric oxide and cyclic GMP in cell signaling and drug development[J].N Engl JMed,2006,355(9):2003 -2011.

      [7] Sabri M,Ai J,Knight B,et al.Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase after experimental subarachnoid hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2011,31(1):190 -199.

      [8] Ozum U,Bolat N,Gul E,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene[G894T]polymorphism as a possible risk factor in aneurysmal subarachnoid hemorrhage[J].Acta Neurochir(Wien),2008,150(1):57-62.

      [9] Khurana VG,Sohni YR,Mangrum WI,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms predict susceptibility to aneurysmal subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm[J].J Cereb Blood Flow Metab,2004,24(3):291 -297.

      [10] Starke RM,Kim GH,Komotar RJ,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene single-nucleotide polymorphism predicts cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage[J].JCereb Blood Flow Metab,2008,28(6):1204 -1211.

      [11] Pyne-Geithman GJ,Caudell DN,Prakash P,et al.Glutathione peroxidase and subarachnoid hemorrhage:implications for the role of oxidative stress in cerebral vasospasm [J].Neurol Res,2009,31:195-199.

      [12] Lin CL,Shih HC,Dumont AS,et al.The effect of 17beta-estradiol in attenuating experimental subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm[J].Neurosurg,2006,104(2):298 -304.

      [13] Shao Z,Li J,Zhao Z,et al.Effects of tetramethylpyrazine on nitric oxide/cGMP signaling after cerebral vasospasm in rabbits[J].Brain Res,2010,1361:67 -75.

      [14] Sugawara T,Ayer R,Jadhav V,et al.Simvastatin attenuation of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rats via increased phosphorylation of Akt and endothelial nitric oxide synthase[J].J Neurosci Res,2008,86(16):3635 -3643.

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