張麗霞 劉近春 武 雯 李俊華 秦 濤

1.天津市公安醫(yī)院內(nèi)二科 (天津，300060) 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)是一種與胰島素抵抗(IR)和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷。隨著肥胖和糖尿病患者的增多，NAFLD已成為西方發(fā)達國家慢性肝病的首要病因，并呈現(xiàn)出全球化發(fā)病的趨勢，在我國其亦發(fā)展成為僅次于慢性病毒性肝炎的第二大肝病。其中非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)不僅僅已成為繼丙型肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化之后隱源性肝硬化的重要原因之一，甚至是公認的可以發(fā)展為肝纖維化和肝硬化甚至肝癌的一個病因。本研究觀察了NASH模型4周、8周大鼠血漿中 (TREM-1)水平的變化及其肝臟的病理學(xué)改變，旨在闡明TREM-1在NASH發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠24只 (由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重150～180ɡ。豬油自備;膽固醇 (南京建成生物工程研究所);鱟試劑定量檢測試劑盒 (廈門市鱟試劑實驗廠有限公司);ALT、AST試劑盒 (南京建成生物工程研究所);TNF-α試劑盒 (解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所);IL-6、IL-10試劑盒 (上海森雄科技實業(yè)有限公司);TREM-1 ELISA試劑盒 (上海麥莎生物科技有限公司);Hovapath TM型酶標儀：BIO-RAD;Mistral 2000R低溫超速離心機：日本SANYO公司;UV-2102C型分光光度計：尤尼柯 (上海)儀器有限公司;OLYMPUSBH-2顯微照相系統(tǒng)：日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會社。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制作 參考邢凌翔非酒精性脂肪性肝炎模型的建立［1］，SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為兩組：對照組、模型組，每組12只。

1.2.2 動物處理 于實驗第 4周、8周末，禁食過夜，次日稱量體重后以1.0%戊巴比妥鈉 (3.0ml/100g體重，ip)麻醉，手術(shù)開腹，在無菌無熱原條件下，分別從腹主動脈、門靜脈采血5.0ml，離心4000轉(zhuǎn)/分，15分鐘，吸取上清液置 -70℃保存，待測 TNF-α、AST、ALT、IL-6、IL-10、TREM-1及ET等;分離肝臟之后迅速從肝右葉中部切取1小塊肝組織置于-70℃冷凍保存?zhèn)溆?，用ELISA方法檢測肝臟TREM-1;取部分肝右葉放于10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋，4μm切片，作HE染色后，在顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)變化情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示，進行單因素ANOVA(方差分析)，相關(guān)性研究采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肝臟TREM-1含量的變化 見表1。

2.2 兩組大鼠血漿ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10含量的變化 見表2。

2.3 肝臟病理組織學(xué)改變 肉眼觀察，正常大鼠肝臟外觀呈紅褐色，有光澤，質(zhì)地柔軟而富有彈性，被膜光滑，邊緣銳利，切面光潔;光鏡下可見正常對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞索排列整齊，肝竇正常，肝細胞無明顯病變，核大圓居中，肝竇排列規(guī)則。模型組大鼠肝臟較正常組色澤暗淡，可見局部黃白色的變性灶，質(zhì)地較硬，體積明顯增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，切面油膩。光鏡下所有模型組動物均出現(xiàn)程度不同的彌漫性肝細胞脂肪變性，主要為小泡性脂肪變性。模型組所有標本小葉內(nèi)均可見炎癥細胞浸潤或散在的點狀或融合壞死，病變程度隨時間延長而加重。

表1 4周、8周時各組大鼠肝臟TREM-1含量的變化

2.4 直線相關(guān)性分析 肝臟TREM-1和 TNF-α、IL-6、ET呈正相關(guān) (r值分別為 0.83，0.85，0.76，P ＜ 0.01); 與 IL-10負相關(guān) (r值為 -0.83，P ＜0.01)。

3 討論

從2000年國外研究人員［2］發(fā)現(xiàn)TREM以來，TREM受到越來越多的關(guān)注。TREM是一種新型的免疫球蛋白超家族炎癥觸發(fā)受體。人類TREM至少包括TREM-1和TREM-2這兩個激活受體和一個抑制受體TLT-1。而在小鼠體內(nèi)除了TREM-1和TREM-2外，還存在TREM-3。

TREM-1是TREM家族中較早被發(fā)現(xiàn)并被研究的一員，由于其在機體炎癥反應(yīng)中起到相當重要的作用而一直受到廣泛的關(guān)注?？茖W(xué)家通過克隆TREM-1cDNA全長發(fā)現(xiàn)，這種選擇性的表達于血液中的中性粒細胞和單核/巨噬細胞表面的模式識別受體是一種跨膜蛋白，它的胞外區(qū)由一個V型結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，胞漿區(qū)很短，僅有5個氨基酸組成，跨膜區(qū)包括一個帶正電荷的賴氨酸殘基［2］。新近研究發(fā)現(xiàn)TREM-1配體可能位于血小板表面，且與白細胞活性相關(guān)［3］。TREM-1的表達主要受細菌、真菌及細菌代謝產(chǎn)物脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)的調(diào)節(jié)。TREM-1在LPS等刺激下表達水平不僅升高而且有促進炎性因子分泌的作用［2，4］，其與配體結(jié)合后能誘導(dǎo)中性粒細胞和單核細胞分泌TNF-α、IL-1β、INF-γ等炎癥因子以及中性粒細胞趨化因子IL-8、單核細胞趨化性蛋白 (MCP-1、MCP-3和巨噬細胞炎癥反應(yīng)蛋白MIP-1α;活化單核細胞表面CD40、CD86和CD54等共同刺激分子，還能誘導(dǎo)中性粒細胞釋放髓過氧化物酶［2］和磷脂酶C酪氨酸磷酸化;可以使中性粒細胞迅速脫顆粒、呼吸爆發(fā)及吞噬作用，并能中和Toll樣受體激活后介導(dǎo)的抗細胞凋亡作用［5］，從而導(dǎo)致“過度”炎癥反應(yīng)，最終可引起炎癥反應(yīng)的增強、放大。

表24 周、8周時各組大鼠血漿ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10檢測值比較(±s)

表24 周、8周時各組大鼠血漿ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10檢測值比較(±s)

與同期對照組比較，*P＜0.05

時間 組別 ALT(IU/L) AST(IU/L) TNF-α(ng/ml) ET(EU/L) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml)4 周 對照組 (n=6) 73.05 ±5.09 31.13 ±1.24 1.11 ±0.03 0.04 ±0.01 27.96 ±5.81 32.71 ±2.34模型組 (n=6) 89.42 ±18.31* 50.99 ±6.73* 1.99 ±0.02* 0.06 ±0.01* 33.53 ±3.60 13.14 ±4.29*8 周 對照組 (n=6) 73.88 ±4.78 33.97 ±4.43 1.12 ±0.04 0.04 ±0.01 28.80 ±1.29 32.87 ±2.11模型組 (n=6) 92.86 ±1.51* 79.93 ±13.35* 2.08 ±0.03* 0.07 ±0.01* 38.51 ±5.33* 13.12 ±1.74*

在正常組織中，TREM-1選擇性的表達于肺泡巨噬細胞表面，從而可以清除病原體、凋亡細胞和大分子物質(zhì)［6］。而且在浸潤的中性粒細胞以及被感染的皮膚上皮細胞和被革蘭氏陰性菌、陽性菌或真菌感染的淋巴結(jié)中，TREM-1也均呈現(xiàn)出高表達現(xiàn)象［7］，TREM-1這種在細胞和組織中的分布特點提示它可能參與了炎癥反應(yīng)。之后的相關(guān)研究表明與健康人群相比，急性胰腺炎患者體內(nèi)TREM-1mRNA表達量不僅明顯增加，而且在炎癥的不同階段其表達量亦明顯不同，提示TREM-1與炎癥程度密切相關(guān)［8］;Detemann 等［9］人對細菌性腦膜炎患者進行回顧性研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)TREM-1表達被上調(diào)，阻斷TREM-1可以消除LPS所引起的感染性休克［10］;急性內(nèi)毒素血癥時，肝巨噬細胞和內(nèi)皮細胞也表現(xiàn)出TREM-1高表達的現(xiàn)象［11］，故TREM-1最初被認為僅在急性炎癥時發(fā)揮作用，并且此觀點得到了普遍的認可［7］。正常腸道單核巨噬細胞無TREM-1的表達，從而防止了腸道內(nèi)微生物引起的過度炎癥反應(yīng)［12］，而Mirjam等［13］人經(jīng)動物和臨床實驗卻發(fā)現(xiàn)在慢性炎癥性腸疾病中TREM-1不僅呈現(xiàn)出高表達現(xiàn)象，而且和疾病的活動性密切相關(guān)。后研究表明在肝臟慢性肉芽腫性炎、消化性潰瘍病及潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn病等慢性炎癥疾病中 TREM-1的表達均表現(xiàn)為高水平狀態(tài)［13～15］，說明TREM-1不僅參與急性炎癥反應(yīng)而且在慢性炎癥性疾病中也有著不可忽略的作用。

本實驗鑒于上述思路設(shè)計了此次研究，在研究所得結(jié)果中發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，模型組大鼠TREM-1在4周時表達量即已明顯增高，8周時更加明顯，而且模型組TNF-α、IL-6、內(nèi)毒素 (ET)均明顯升高，IL-10表達量卻下降，說明在此次的NASH模型中伴有腸源性內(nèi)毒素血癥 (IETM)的形成。相關(guān)分析顯示，TREM-1與ET、TNF-α、IL-6均呈正相關(guān)，而與IL-10呈負相關(guān)，提示TREM-1不僅可能通過誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等炎癥因子的高表達以及IL-10的低表達而參與NASH的發(fā)展，而且通過IETM可能也參與了NASH的發(fā)生以及對肝臟的損害，其機制可能是：IETM時，LPS經(jīng)Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR-4)識別后，通過TLR-4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活了NF-κB，促炎因子TNF-α、IL-6表達上調(diào)而抗炎因子IL-10表達下調(diào)，促炎介質(zhì)與抗炎介質(zhì)處于失平衡狀態(tài)，無法正常維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，使得肝細胞受損，轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST表達升高。同時受LPS調(diào)節(jié)呈現(xiàn)高表達的TREM-1與接頭蛋白DAP-12偶聯(lián)后［16］，通過其介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化、絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)的激活等將轉(zhuǎn)錄復(fù)合物激活，協(xié)同NF-κB促進炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，使得單核細胞分泌大量TNF-α、IL-6等促炎因子，而抗炎因子IL-10受抑制呈現(xiàn)低水平表達，進而促進了促炎介質(zhì)與抗炎介質(zhì)之間的不平衡，加重了肝臟的損害。這樣在眾多細胞因子的共同作用下導(dǎo)致了肝細胞受損，在此過程中TREM-1與TLR-4通過協(xié)同作用共同介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，其中TREM-1主要是擴大由TLR-4啟動的炎癥反應(yīng)。

［1］邢凌翔，賀永文.氧四環(huán)素腹腔注射制備大鼠非酒精性脂肪肝模型的實驗研究［J］.臨床肝膽病雜志，2007，2(23)：29-31.

［2］BOUCHON A，DIETRICH J，COLONNA M.Cutting edge：inflammatory responses can be triggered by TREM-1，a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes［J］.Immunol，2000，164(10)：4991-4995.

［3］ALAN T.Paquita.Chapter57：Inherited disorders of platelet function［J］.Blood，2007，110(3)：794-795.

［4］BLEHURSKI JR，KIESSLER V，BUONSANTI C，et al.A role for triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in host defense during the early-induced and adaptive phases of the immune response ［J］.Immunol，2003，170(7)：3812-3818.

［5］RODSAK MP，SALIH HR，RAMMENSEE HG，et al.Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in neutron-phil inflammatory responses：differential regulation of activation and survival［J］.Immunol，2004，172(8)：4956-4963.

［6］ALLCOCK RJ，BARROW AD，F(xiàn)ORBEA S，et al.The human TREM gene cluster at 6p21.2 encoded both neiviting and inhibitory single IgV Romain receptor and includes NKp44 ［J］.Immunol，2003，33(2)：557-577.

［7］BOUCHON A，F(xiàn)ACCHETTI F，WEIGAND MA，et al.TREM-1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock［J］.Nature，2001，410(6832)：1103-1107.

［8］DA-YU YANG REN-YI QIN，ZHENG-REN LIU，et al.Expression of TREM-1mRNA in acute pancreatitis［J］.World Journal of Gastroenterology，2004，10(18)：2744-2746.

［9］DETERMANN RM，WEISFELT M，DE GANS J，et al.Soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 1：a biomarke for bacterial meningitis ［J］.Intensive CareMed，2006，32(8)：1243-1247.

［10］GIBOT S，BUONSANI C，MASSIN F，et al.Modulation of the triggering receptor expressed on the myeloid cell type 1 pathway in murine septic shock ［J］.Immunol，2006，74(5)：2823-2830.

［11］LI C.CHEN，JEFFREY DL，MARION KG，et al.Regulation of TREM expression in hepatic macrophages and endothelial cells during actute endotoxemia ［J］.Experimenta land Molecular Pathology，2008，84(2)：145-155.

［12］SCHENK M，BOUCHON A，BIRRER S，et al.Macrophages expressing triggering receptor on myeloid cells-1 are underrepresented in the human intestine ［J］.Immunol，2005，174(1)：517-524.

［13］MIRJAM SCHENK，AXEL BOUCHON，F(xiàn)RANK SEIBOLD，et al.TREM-1 expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases［J］.The Journal of Clinical Investigation，2007，117(10)：3097-3106.

［14］HISTOSHI N，NAOKO A，KENSUKE Q，et al.Modulation of Hepatic Granulomatous Responses by Transgene Expression of DAP12 or TREM-1-Ig Molecules ［J］.American Journal of Pathology，2003，162(4)：1191-1201.

［15］KOUSSOULAS V ，VASSILION S，DEMONAKON M，et al.Soluble triggering receptor expressed on myeloid cells：a new mediator involved in the pathogenesis of peptic ulcer disease［J］.Gastroenterol Hepatology，2006，18(4)：375-379.

［16］ANJA S.T.，Adelheid C.The TREM-1/DAP12 pathway ［J］.Immunology Letters，2008，116(2)：111-116.