李炫麗，王世才，許雙全

（湖北省種子集團(tuán)有限公司禾盛生物育種研究院，武漢 430070）

水稻單粒種子DNA提取及SSR-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

李炫麗，王世才，許雙全

（湖北省種子集團(tuán)有限公司禾盛生物育種研究院，武漢 430070）

本文以水稻單粒干種子為材料進(jìn)行DNA提取方法和SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究，結(jié)果表明：用CTAB法提取的水稻干種子DNA較為完整，降解量少，可獲得理想的擴(kuò)增效果。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，確定的最佳反應(yīng)體系為20 μL，其中含模板DNA 45ng，dNTPs濃度為0.15 mmol/L，引物濃度為0.4 μmol/L，Mg2+濃度為1.5 mmol/L，Taq酶為1.6 U。

水稻；種子；CTAB法；SDS法；SSR-PCR體系優(yōu)化

我國(guó)是世界上第一個(gè)在生產(chǎn)上利用水稻雜種優(yōu)勢(shì)的國(guó)家，雜交水稻的推廣對(duì)大幅度提高水稻單產(chǎn)起了巨大作用。但是，由于種子質(zhì)量問(wèn)題給農(nóng)戶造成嚴(yán)重減產(chǎn)的事件時(shí)有發(fā)生。因此，種子質(zhì)量（主要是真實(shí)性和純度）控制顯得尤為重要。如何能更快更有效地鑒定和檢驗(yàn)雜交水稻種子純度和品種真實(shí)性，已成為種子生產(chǎn)和銷(xiāo)售中亟待解決的問(wèn)題之一。

SSR（Simple Sequence Repeats）標(biāo)記是指以 2 ～ 6個(gè)堿基為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛分布于水稻基因組中。由于SSR分子標(biāo)記具有分布廣泛、共顯性遺傳、結(jié)果穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，在指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等方面有著廣泛的應(yīng)用[1]，在生產(chǎn)指導(dǎo)中常用于雜交水稻品種真實(shí)性和純度鑒定。

在雜交水稻純度鑒定和真實(shí)性鑒定過(guò)程中，大多數(shù)工作人員常選取幼小植株或幼嫩葉片為材料進(jìn)行植物基因組提取，這種方法不僅費(fèi)時(shí)（種子發(fā)芽一般需要4～6天），且步驟繁瑣，很難適應(yīng)如今種子貿(mào)易的快節(jié)奏。為了縮短檢測(cè)時(shí)間，提高工作效率，最好選擇干種子進(jìn)行基因組DNA的提取。匡猛等[2]以棉種為材料，探索出一種適合棉花品種SSR分析的DNA快速提取方法；McDonald等[3]從玉米、棉花、小麥及三葉草的干種子中提取DNA，并成功擴(kuò)增出特異性片段；Yoshihash等用磨碎的谷粒提取了水稻基因組DNA，并對(duì)該水稻品種進(jìn)行了遺傳分析[4]。

SSR技術(shù)對(duì)反應(yīng)條件要求較為嚴(yán)格，研究體系的穩(wěn)定性和可重復(fù)性成為SSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用的主要因素。不同作物間的SSR標(biāo)記擴(kuò)增會(huì)出現(xiàn)較大差異，因此有必要對(duì)水稻SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。本研究對(duì)影響SSR擴(kuò)增結(jié)果的模板DNA含量、Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度和酶的濃度及水稻單粒種子DNA提取方法等因素進(jìn)行了探討，旨在建立一套成熟穩(wěn)定的SSR分子標(biāo)記技術(shù)反應(yīng)體系，使SSR標(biāo)記技術(shù)更好地為雜交水稻純度檢驗(yàn)、種質(zhì)資源鑒定及分子標(biāo)記育種等工作服務(wù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以雜交水稻品種兩優(yōu)287干種子、揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)干種子為材料。

1.2 DNA提取的方法

1.2.1 SDS法：取一粒水稻干種子，剝?nèi)シf殼，放入預(yù)冷的研缽內(nèi)，磨碎后將粉末放入1.5 mL離心管中；加入800 μL預(yù)熱的 SDS提取 buffer（50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0；2.5 mmol/L EDTA，pH=8.0；300 mmol/L NaCl；1%SDS），65 ℃水中溫浴 1h；4 ℃、10000 r/min離心15 min,吸上清，加等體積的平衡酚和氯仿/異戊醇 （24∶1）上下顛倒混勻；4℃、10000 r/min離心15 min，將上清夜吸出至另一個(gè)1.5 mL的離心管中,加入等體積異丙醇混勻，于-20℃冰箱冷凍3～4 h；4℃、10000 r/min離心15 min后棄上清，用預(yù)冷70%乙醇洗滌沉淀2遍，37℃干燥；加50 μL超純水溶解，-20℃儲(chǔ)存。

1.2.2 CTAB法：取一粒水稻干種子，放入預(yù)先冷凍好的研缽內(nèi)，加入 800 μL CTAB裂解液 （2%CTAB；100 mmol/L Tris-HCl，pH 為 8.0；50 mmol/L EDTA，pH為 8.0；3%PVP；1.4 mol/LNaCl）， 迅速研磨充分并轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，65℃恒溫水浴1 h，降至室溫后加入等體積的24∶1氯仿/異戊醇，12000 r/min離心15 min；取上清，加入等體積的1%CTAB沉淀緩沖液；輕輕搖晃至形成絮狀沉淀，5000 r/min離心8 min沉淀DNA；加入2 mL的 1 mol/LNaCl及 1 μg/mL的 RNAase37℃水浴中過(guò)夜。24∶1氯仿/異戊醇再抽提一次，加入異丙醇沉淀DNA，預(yù)冷后用70%酒精洗沉淀兩次，干燥；加入50 μL超純水，-20℃儲(chǔ)藏備用。

1.3 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

本試驗(yàn)以?xún)上惦s交水稻兩優(yōu)287為材料，RM17為引物，對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行多因素多水平的20 μL反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)對(duì)DNA模板含量、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶濃度共5個(gè)因素分別設(shè)計(jì)4個(gè)濃度梯度水平，共16個(gè)處理的正交設(shè)計(jì)，各反應(yīng)因素水平見(jiàn)表1。每個(gè)反應(yīng)體系均加入2.0 μL 10xTaq DNA Pol.Buffer，最后加 ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min，94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s， 共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)EB染色后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，保存。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各反應(yīng)物濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響

如圖1所示，用CTAB法和SDS法提取水稻干種子DNA都是可行的。用CTAB法提取的DNA條帶較亮，DNA也較為完整，能獲得較好的擴(kuò)增效果；而SDS法提取的DNA條帶較弱，DNA也有輕微的降解。

如圖2所示，在同樣的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件下，以CTAB法提取的DNA為模板能擴(kuò)增出清晰的條帶；而以SDS法獲得的的模板雖然也能擴(kuò)增出目的帶，但擴(kuò)增效果稍差，目的條帶較弱，可能是未經(jīng)純化的模板含有蛋白及其它雜質(zhì)，影響了擴(kuò)增效果。

2.2 水稻SSR-PCR反應(yīng)最優(yōu)體系的確定

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的16個(gè)反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，除第15個(gè)反應(yīng)體系沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，其余15個(gè)均有擴(kuò)增條帶，可見(jiàn)試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的各試驗(yàn)因素濃度梯度沒(méi)有偏離最適范圍。其中，1～4反應(yīng)體系在模板濃度較低的情況下，依次分別增加dNTPs濃度、引物濃度、Taq酶濃度及Mg2+濃度，其擴(kuò)增條帶逐漸變亮，擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增多，說(shuō)明在DNA模板濃度一定的情況下，適當(dāng)增加其余各反應(yīng)成分濃度可以提高擴(kuò)增產(chǎn)物量；4～16組合雖然模板濃度加大，但大多組合擴(kuò)增產(chǎn)物亮度與3、4相當(dāng)，說(shuō)明在合理的范圍內(nèi)，模板濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不大，微量的DNA便可擴(kuò)增出產(chǎn)物；8組合的擴(kuò)增產(chǎn)物較少，15組合幾乎沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，在8、15反應(yīng)組合dNTPs濃度、引物濃度和Taq酶濃度都處于中等水平的情況下，Mg2+濃度均為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最低水平，所以推測(cè)它們擴(kuò)增產(chǎn)物量少可能跟Mg2+濃度較低有關(guān)；9、10、16組合擴(kuò)增產(chǎn)物亮度較其余組合擴(kuò)增條帶明顯變亮，擴(kuò)增產(chǎn)物較多。從經(jīng)濟(jì)實(shí)用的角度考慮，確定9反應(yīng)為最佳反應(yīng)組合，即20 μL反應(yīng)體系中含模板DNA 45ng，dNTPs濃度為 0.15 mmol/L，引物濃度為 0.4 μmol/L，Mg2+濃度為 1.5 mmol/L，Taq 酶為 1.6 U。

2.3 最優(yōu)反應(yīng)體系的檢測(cè)

為了檢測(cè)上述試驗(yàn)篩選出來(lái)的最優(yōu)反應(yīng)體系的擴(kuò)增效果，本研究對(duì)雜交水稻揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)種子進(jìn)行純度檢測(cè)，所用引物為RM1。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，28粒種子都擴(kuò)增得到了清晰且特異性較高的條帶，表明本研究所篩選出來(lái)的反應(yīng)體系具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3 討論

SSR分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯現(xiàn)性遺傳、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，因此在遺傳多樣性分析[5]、基因的定位與分離[6]、品種純度鑒定[7]等方面得到了日益廣泛的應(yīng)用。

雖然SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)模板DNA質(zhì)量和濃度要求不高，但是高質(zhì)量的DNA是實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠并有穩(wěn)定重復(fù)性的有力保證。用水稻單粒干種子進(jìn)行DNA提取時(shí)，SDS法步驟少，用時(shí)少，但提取的DNA純度較低，擴(kuò)增效果也稍差；而CTAB法提取水稻干種子DNA時(shí)，雖然步驟和用時(shí)稍多，但提取的DNA質(zhì)量高，擴(kuò)增效果好。在進(jìn)行SSR-PCR反應(yīng)中，模板DNA如果含有多糖、酚類(lèi)、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，會(huì)影響DNA聚合酶活性，干擾引物與模板的結(jié)合。所以，為了保證擴(kuò)增的穩(wěn)定性和高效性，在進(jìn)行水稻干種子DNA抽提時(shí)，建議選用CTAB法。

SSR-PCR反應(yīng)涉及的反應(yīng)因子多，對(duì)反應(yīng)條件十分敏感。任何一個(gè)反應(yīng)因子設(shè)置不當(dāng)，都會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果。模板濃度是PCR反應(yīng)的制約因子之一，如果其濃度過(guò)低，與引物碰撞機(jī)會(huì)較少，結(jié)合概率降低，則擴(kuò)增產(chǎn)物量較少或擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定；如果其濃度過(guò)高，則會(huì)增加非特異性擴(kuò)增[8]。本研究用15～45 ng的4個(gè)DNA濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)增，除15反應(yīng)，其余反應(yīng)都擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明模板濃度在相當(dāng)范圍內(nèi)都能擴(kuò)增出結(jié)果。Mg2+是Taq酶的激活劑，適量濃度的Mg2+可以促進(jìn)Taq酶充分發(fā)揮聚合作用。但是，如果Mg2+濃度過(guò)高，會(huì)增加非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增；濃度過(guò)低，會(huì)使反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)物減少或者沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物[9]。本試驗(yàn)中共設(shè)計(jì)了4個(gè)Mg2+濃度梯度，當(dāng)Mg2+濃度為1.0mmol/L時(shí)，反應(yīng)1、反應(yīng)8擴(kuò)增條帶很弱，反應(yīng)15基本沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，可能是Mg2+濃度較低，影響了酶活性的緣故。dNTPs是DNA合成的原料，濃度低時(shí)影響擴(kuò)增結(jié)果；濃度過(guò)高，會(huì)與Taq酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Mg2+，使酶反應(yīng)活性降低，從而降低擴(kuò)增效率[9]。Taq酶也是反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一，酶的質(zhì)量、濃度也直接影響擴(kuò)增結(jié)果?？傊?，PCR擴(kuò)增效果是體系中各個(gè)因素綜合作用的結(jié)果，每個(gè)反應(yīng)因子濃度的高低及各反應(yīng)因子間的相互作用都直接影響反應(yīng)結(jié)果。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究多因素、多水平相互作用的一種較新的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，具備“均勻分散、齊整可比”的特點(diǎn)[10]，而PCR反應(yīng)體系所含組分多，且各組分均可能對(duì)擴(kuò)增敏感性、特異性等產(chǎn)生影響。因此，在本研究中采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，借助正交表來(lái)篩選最佳反應(yīng)組合，大大減少了試驗(yàn)次數(shù)，又快又好地篩選最優(yōu)組合。篩選出的最經(jīng)濟(jì)、最穩(wěn)定的體系為：20 μL反應(yīng)體系中含模板DNA 45ng，dNTPs濃度為 0.15 mmol/L，引物濃度為 0.4 μmol/L，Mg2+濃度為 1.5 mmol/L，Taq 酶為1.6 U。

本研究以1個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)16個(gè)不同反應(yīng)體系進(jìn)行了篩選，并對(duì)篩選出的最優(yōu)體系進(jìn)行了擴(kuò)增檢驗(yàn)。結(jié)果表明，試驗(yàn)篩選出最優(yōu)反應(yīng)體系具有穩(wěn)定、高效和可重復(fù)性的特點(diǎn)，可應(yīng)用于水稻基因的定位、種質(zhì)鑒定及雜交水稻純度鑒定等方面。

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1005-2690（2011）06-0020-04

S 511.037

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2011-05-09