陳曉明，柳 芳，鄭 春，李曉燕，張建國，嚴(yán)萬里

（1.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010；2.中國工程物理研究院 核物理與化學(xué)研究所，四川 綿陽 621900）

自1956年美國Ethicon公司首次應(yīng)用電子直線加速器對外科縫線的滅菌成功后，電離輻射滅菌技術(shù)迅速發(fā)展。電離輻射通過電離激發(fā)作用，改變各種生物大分子的結(jié)構(gòu)功能，從而改變細(xì)胞功能、代謝、結(jié)構(gòu)，以及機(jī)體組織、器官、系統(tǒng)及其相互關(guān)系，最終導(dǎo)致機(jī)體的損傷［1］?？莶菅挎邨U菌（Bacillussubtilis）是一種革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)生對熱、紫外線、電離輻射和某些化學(xué)藥品有很強(qiáng)抗性的芽孢，在醫(yī)藥衛(wèi)生中常被作為熱力、高壓、電離輻射滅菌的指示菌。芽孢對電離輻射的耐受性較強(qiáng)，高劑量下的存活率也較高［2－3］，目前輻照滅菌主要集中研究電離輻射對芽孢的損傷效應(yīng)，對營養(yǎng)體的相關(guān)研究較少。實(shí)際上枯草芽孢桿菌也常以營養(yǎng)體的形式存在，因此考查電離輻射對營養(yǎng)體的損傷效應(yīng)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)通過對細(xì)胞存活率、超氧化物岐化酶（SOD）活性及DNA雙鏈斷裂水平的研究，考查γ輻照對枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體的損傷效應(yīng)，旨為輻射滅菌效應(yīng)和機(jī)理的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillussubtilisvar.niger，ATCC 9372），購于中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體制備

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，定容至1 000mL）培養(yǎng)菌體，37℃，160r／min振蕩培養(yǎng)16h，按10%比例接入新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12h，離心收集菌體，PBS（無水磷酸氫二鈉2.83g，磷酸二氫鉀1.36g，蒸餾水1 000mL）洗滌1次，PBS復(fù)溶。分裝于2mL凍存管（PP材料）。

1.3 輻照處理

本研究按γ輻照吸收劑量設(shè)置50、200、800、1 400、2 000Gy和空白對照共6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，吸收劑量率為15Gy／min。γ輻照在中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所的60Co源上進(jìn)行。輻照后樣品分為3份，分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、胞內(nèi)SOD活性測定和DNA雙鏈斷裂水平檢測。

1.4 細(xì)胞存活率檢測

采用平板計(jì)數(shù)的方法檢測細(xì)胞存活率。取100μL樣品加入至900μL PBS中進(jìn)行倍比稀釋，振蕩混勻后取100μL到NA固體培養(yǎng)基上涂板，于37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)，以菌落數(shù)在30～300之間為有效數(shù)據(jù)。細(xì)胞存活率＝輻照后活菌數(shù)／輻照前菌數(shù)。

1.5 胞內(nèi)SOD活性測定

輻照樣品離心棄上清，加入等量溶菌酶液（4mg／mL），于37℃下溫育30min，超聲處理25min，5 000r／min×10min，4℃離心取上清即為粗酶液。胞內(nèi)SOD活性測定采用黃嘌呤氧化法（南京建成試劑盒）。用酶標(biāo)儀（Thermo，Multiskan spectrum）測定550nm 處吸光值。規(guī)定每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位（U）。

1.6 DNA雙鏈斷裂分析

DNA雙鏈斷裂水平（DSB）檢測選用脈沖場凝膠電泳（PFGE）法。脈沖場電泳樣品的制備及電泳條件參照文獻(xiàn) ［3－4］。標(biāo)準(zhǔn)DNA采用225kb～2.2Mb的酵母染色體DNA（Bio－Rad公司產(chǎn)品）。用Quantity one軟件分析各泳道DNA熒光強(qiáng)度，DNA的釋放百分比值（PR）定義為各泳道中已移出加樣孔的DNA熒光強(qiáng)度所占該泳道中總DNA熒光強(qiáng)度比值。采用平均分子量法［5］計(jì)算DNA斷裂產(chǎn)額L（DSBs／kb），定量DNA斷裂水平，則：

式中：m為細(xì)胞中線狀雙鏈DNA分子的條數(shù)；X為DNA分子的總長，Mbp；PR為輻照后產(chǎn)生的DNA片段釋放百分比與對照的差值；T為DSB片段平均大小，Mbp。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ輻照對枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體的滅菌效果

枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體受到吸收劑量為50～2 000Gy的γ輻照后，細(xì)胞存活率隨劑量不斷下降（圖1）。運(yùn)用SPSS 10.0對存活率作回歸分析，得到方程y＝－0.635－0.001x，R2＝0.831（y為存活率的對數(shù)值；x為γ輻照吸收劑量，Gy）。根據(jù)方程求出D10＝365Gy（D10為被輻照物中的細(xì)菌總數(shù)降低到原始值1／10時(shí)所需的吸收劑量，它反映了細(xì)菌對電離輻射的耐受能力）。從圖1可看出，在低劑量輻照（≤800Gy）時(shí)，存活率隨著輻照劑量急劇下降，在800Gy劑量時(shí)，存活率為0.25%，當(dāng)劑量大于800Gy時(shí)，存活率下降趨勢較為平緩。

本研究之前采用γ輻照枯草芽孢桿菌芽孢樣品，得到輻照吸收劑量與細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系滿足方程y＝ －0.000 37x，R2＝0.951 3，D10為2 700Gy。對D10水平比較，γ輻照營養(yǎng)體的滅菌效果約是芽孢樣品的7.4倍。

圖1 γ輻照對枯草芽孢桿菌的滅菌效果Fig.1 Sterilizing effect ofγ－rays on Bacillus subtilis vegetative cells

2.2 γ輻照對枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體胞內(nèi)SOD活性的影響

不同劑量γ輻照對枯草芽孢桿菌胞內(nèi)SOD活性影響顯著（圖2）?？莶菅挎邨U菌經(jīng)γ輻照后，胞內(nèi)SOD活性均顯著低于對照（p＜0.01）。由圖2可見，當(dāng)輻照劑量為50Gy時(shí)，胞內(nèi)SOD活性最低，僅為對照的54.9%，而200Gy輻照下酶活性明顯上升，隨著劑量的繼續(xù)增大，酶活性先降低后升高。輻照劑量大于800Gy時(shí)，SOD活性隨劑量持續(xù)升高（p＜0.01）。對于SOD活性隨劑量的這種奇怪變化現(xiàn)象，推測可能與γ輻照對胞內(nèi)SOD活性的影響受到多種因素的調(diào)節(jié)有關(guān)。首先，SOD作為抗氧化體系中的成員，其活性受到其他抗氧化酶表達(dá)的影響；另外，高劑量下SOD酶活性隨輻照劑量的增大而升高的現(xiàn)象可表明SOD活性還可能受到自由基的影響，隨劑量增大累積較多自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞SOD的表達(dá)功能增強(qiáng)，使胞內(nèi)SOD活性不斷上升。對于上述推測有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

圖2 γ輻照對枯草芽孢桿菌胞內(nèi)SOD活性的影響Fig.2 Effect ofγ－rays on Bacillus subtilis SOD activity

2.3 γ輻照誘導(dǎo)的枯草芽孢桿菌DSB水平

分析輻照后DNA單雙鏈斷裂情況具有很大價(jià)值［6］。圖3所示為輻照樣品脈沖場凝膠電泳圖。由圖3可看出，隨著輻照劑量的增大，加樣孔附近的熒光條帶逐漸減弱并最終消失，同時(shí)條帶末端小分子量的熒光逐漸加強(qiáng)，即隨著γ劑量的增大，大分子片段不斷減少而小分子片段逐漸增加。

用Quantity one軟件分析圖3中條帶的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算PR與L。圖4a和b分別為PR與L隨γ劑量的變化關(guān)系。由圖4可看出，PR和L均隨劑量不斷增大并逐漸趨于飽和。這與Cedervall等［7］的結(jié)果一致。對PR及L分別進(jìn)行回歸分析，PR滿足方程y＝－44.517＋13.998lnx，R2＝0.952（y為DSB的釋放百分比；x為γ輻照吸收劑量，Gy）。L滿足方程y＝－10 156.700＋2 655.337lnx，R2＝0.923（y為DSB的斷裂產(chǎn)額；x為γ輻照吸收劑量，Gy）。

圖3 γ輻照后枯草芽孢桿菌脈沖場電泳圖Fig.3 PFGE electrophoretogram of Bacillus subtilis afterγradiation

圖4 γ輻照誘導(dǎo)的枯草芽孢桿菌DSB水平Fig.4 DSB level of Bacillus subtilis induced byγradiation

3 討論

3.1 輻射滅活細(xì)菌營養(yǎng)體和芽孢的效應(yīng)差異

有研究得到γ輻照滅活枯草芽孢桿菌芽孢樣品的劑量為1.7～2.5kGy［8］；我們也曾得到同樣條件下的γ輻照對枯草芽孢桿菌芽孢樣品的D10為2 700Gy；另外，在考查紫外線的損傷效應(yīng)時(shí)，得到枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體和芽孢樣品的D10分別為9.84和47.98J／cm2［3］。這些結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的不同存在狀態(tài)對電離輻射的耐受性差異很大，芽孢狀態(tài)的輻射抗性遠(yuǎn)大于營養(yǎng)體。電離輻射的種類、細(xì)胞存在狀態(tài)、細(xì)胞載體、干燥程度等均會影響電離輻射的生物損傷效果［9－10］。

3.2 γ輻照對細(xì)菌胞內(nèi)抗氧化酶活性和DNA的影響

電離輻射的生物損傷效應(yīng)是電離輻射的直接電離激發(fā)、自由基的氧化損傷以及細(xì)胞自身修復(fù)協(xié)同作用的結(jié)果。在本研究體系中，由于菌體存在于水溶液中，γ輻照會誘發(fā)水產(chǎn)生大量的氧自由基，因此對生物體的傷害以間接作用為主，主要包括自由基等對生物酶活性及對DNA的損傷。SOD是一種清除體內(nèi)超氧陰離子自由基的金屬酶類，其結(jié)合的金屬種類不同，可將SOD 分為3類：Cu／Zn－SOD、Mn－SOD和Fe－SOD。而枯草芽孢桿菌主要含有Mn和Fe－SOD同工酶。枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體的SOD活性隨輻照劑量變化的結(jié)果顯示，SOD活性與劑量無明顯的相關(guān)性，尤其在低劑量輻照下，隨劑量的變化無明顯規(guī)律。這可能是因?yàn)镾OD主要是使超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過氧化氫，但它并非生物體清除氧損害的最終酶類，生成的過氧化氫要由體內(nèi)的過氧化氫酶等來最終清除。過氧化氫作為機(jī)體內(nèi)的信號分子，會刺激其他一些抗氧化酶的表達(dá)，同時(shí)也會對酶的活性造成損傷。因此，電離輻射對SOD活性的效應(yīng)受到多種因素調(diào)節(jié)，各種抗氧化酶之間的相互影響，抗氧化酶體系與自由基之間的動(dòng)態(tài)效應(yīng)均會影響其活性，因此欲研究電離輻射抗氧化酶的效應(yīng)，應(yīng)綜合考慮其他幾種抗氧化酶的活性，進(jìn)行深入研究。

電離輻射可引起DNA多種形式的改變，DSB是損傷中常見和重要的形式，其中非修復(fù)性的DSB被認(rèn)為是輻照損傷細(xì)胞最重要的原發(fā)事件。Dahm等［11］認(rèn)為，隨著輻照劑量的增大，DNA雙鏈斷裂加劇，其修復(fù)所需的時(shí)間也增長；但細(xì)胞修復(fù)在照后15h便基本完成，照后24h剩余的DSB即可認(rèn)為是不可修復(fù)的DSB。多數(shù)研究者認(rèn)為非修復(fù)性的DSB可能與細(xì)胞致死有極其密切的關(guān)系。形成不可修復(fù)的DSB可能是因?yàn)榧?xì)胞本身的性質(zhì)和入射粒子的電離特性［12］。自1996年美國Cooper實(shí)驗(yàn)室首先報(bào)道了DSB非隨機(jī)分布的現(xiàn)象后，國內(nèi)外相繼發(fā)現(xiàn) DSB非隨機(jī)分布現(xiàn)象［13－14］。本研究中，枯草芽孢桿菌DNA雙鏈斷裂水平隨γ射線劑量增大而不斷上升。另外，當(dāng)劑量為50～800Gy時(shí)，細(xì)胞DSB明顯增加，同時(shí)細(xì)胞存活率急劇下降，這進(jìn)一步驗(yàn)證DSB與細(xì)胞存活率相關(guān)。DNA作為遺傳信息的載體，其損傷會導(dǎo)致生物大分子結(jié)構(gòu)功能的改變，雖然DSB可能不是造成生物損傷的唯一途徑，但深入研究輻射對DNA的損傷具有十分重要的意義。

4 結(jié)論

γ射線穿透力強(qiáng)、射程遠(yuǎn)，劑量較為均勻，具較強(qiáng)的殺菌力，是常用的電離輻射滅菌手段。本研究采用50～2 000Gy的γ射線輻照枯草芽孢桿菌，從細(xì)胞水平、蛋白水平、分子水平系統(tǒng)考查了γ輻照對枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體的損傷效應(yīng)。在劑量率為15Gy／min時(shí)，得到D10為365Gy，當(dāng)劑量達(dá)800Gy時(shí)，滅菌率達(dá)99.75%，表明γ輻照對枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體有較強(qiáng)的損傷效應(yīng)。

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