趙志剛，張志生，程 杰，陳傳斌，高士祥

南京大學環(huán)境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，江蘇 南京 210046

大型溞母溞暴露于氨氮所產(chǎn)子代對氨氮毒性的耐受性

趙志剛，張志生，程 杰，陳傳斌，高士祥*

南京大學環(huán)境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，江蘇 南京 210046

采用大型溞(Daphnia magna)作為受試生物，在測定了氨氮對大型溞的急慢性毒性效應的基礎上，進一步研究了在慢性毒性試驗中暴露于氨氮環(huán)境下的母溞所產(chǎn)子代對氨氮的毒性響應.急性毒性試驗結(jié)果表明，氨氮對大型溞的24 h和48 h的LC50分別為165.97和69.54 mg/L.21 d慢性試驗結(jié)果表明:大型溞的生長指標——脫皮數(shù)是對氨氮最為敏感的毒性參數(shù);其慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL)分別為1.88和3.75 mg/L;據(jù)此計算出的慢性毒性值(CHV)為2.66 mg/L，急慢性比(ACR)為26.14.在慢性試驗中，暴露于毒物的母體所產(chǎn)的子代幼溞，與對照組相比，其48 hLC50都有所增大(增幅為13.7%～56.2%)，說明對毒物的適應性有所增強.

氨氮;大型溞;急性毒性;慢性毒性;子代

Abstract:The acute and chronic toxicity effects of ammonia nitrogen were studied usingDaphnia magnaas the test organism.The toxicity response of the offspring born by pregnant individuals during chronic exposure to ammonia nitrogen was further studied.The acute toxicity test showed that the 24 hLC50and 48 hLC50of ammonia nitrogen to this organism were 165.97 and 69.54 mg/L，respectively.The results of 21 d chronic toxicity testing showed that the number of exuviations，one of the grow th parameters，was the most sensitive indicator，from which the values of Lower Chronic Limit(LCL)and Upper Chronic Limit(UCL)were determined to be 1.88 and 3.75 mg/L，respectively.The Chronic Value(CHV)was calculated as 2.66 mg/L using theLCLandUCL.A ll the data allowed us to obtain the Acute-to-Chronic Ratio(ACR)as 26.14.In contrastwith the control，the 48 hLC50of ammonia nitrogen to the offspring born by the pregnant individual during the chronic test exposure were greater(increased by 13.7%-56.2%)，which suggested thatmaternal exposure to ammonia nitrogen could improve the adaptability of the offspring to the same chemical.

Keywords:ammonia nitrogen;Daphnia magna;acute toxicity;chronic toxicity;offspring

隨著我國工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，氨氮已經(jīng)成為全國性首要污染.2008年重點流域水污染考核結(jié)果顯示，氨氮已超過化學需氧量(COD)成為影響地表水水環(huán)境質(zhì)量的首要指標.水中氨氮主要來源于生活污水中含氮有機物受微生物作用的分解產(chǎn)物、工業(yè)廢水以及農(nóng)業(yè)面源.研究［1］表明，水中氨氮可降低魚類、甲殼類和軟體動物的能量代謝活動，損害其鰓、肝、腎、脾和甲狀腺組織，并可降低動物體內(nèi)血紅蛋白輸氧的能力，嚴重時可導致死亡.在溶液中總銨由處于平衡態(tài)的非離子氨(NH3)和離子銨)2種形式組成.二者比例主要取決于 pH和其他一些因素.非離子氨 NH3是非極性化合物，有較大的脂溶性，能穿透細胞膜毒害組織.因此，非離子氨的毒性比離子銨大得多［2］.

水溞是世界范圍內(nèi)廣泛分布的枝角類無脊椎動物，已被廣泛應用于污染物的毒性研究［3-7］.這主要是由于其對污染物非常敏感.大型溞(Daphnia magna)是一種重要的水溞代表種.目前對大型溞已有許多研究，但有關暴露于污染物中的母溞所產(chǎn)幼溞對污染物的耐受性還鮮見報道.筆者在研究了氨氮對大型溞急性和慢性毒性的基礎上，對在慢性毒性試驗中母溞所產(chǎn)幼溞的急性毒性進行了評價，以期為了解氨氮對水生態(tài)系統(tǒng)造成的生態(tài)風險和推導保護我國水生生物的氨氮水質(zhì)基準值提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

大型溞為實驗室內(nèi)以斜生柵藻培養(yǎng)的同一母溞所產(chǎn)、培養(yǎng)3代以上的幼溞.

氯化銨(分析純，含量＞99.5%)購于南京化學試劑廠.

儀器主要包括電子天平〔BS124S，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司〕，智能光照培養(yǎng)箱(LRH-250-Gb，廣東韶關鑫騰科普儀器有限公司)，連續(xù)變倍體視顯微鏡(XTZ-E，上海立光精密儀器有限公司)，精密pH計〔PB-10，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司〕，溶氧儀(LIDA820，上海理達儀器廠)和電導率儀(CONscan30，上海理達儀器廠)等.

試驗用水為活性炭過濾并充氧曝氣48 h以上的自來水，試驗前于培養(yǎng)箱中平衡2 h.平衡后水溫為(22±1)℃，pH為7.9～8.0，ρ(溶解氧)＞5 mg/L，電導率為(285±20)μS/cm，總硬度為(118.5±4.2)mg/L(以CaCO3計).

1.2 大型溞急性毒性試驗

取溞齡為6～24 h的新生幼溞，參照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)標準方法［8］進行試驗.先將氯化銨用蒸餾水配制成高濃度母液，再用水稀釋至設定濃度.先進行預試驗以確定正式試驗濃度設定范圍.正式試驗中按幾何級數(shù)濃度系列設置6個濃度，每個濃度設4個平行，同時設空白對照.由于轉(zhuǎn)移大型溞時會夾帶部分水，配制某濃度溶液時均分為A和B 2份，先將大型溞移至A液再移至B液中進行試驗，以盡可能減少水對溶液的稀釋.每個容器中放5只幼溞(滿足生物量≥2 m L/只)，每個濃度共20只.試驗在光照培養(yǎng)箱中進行，培養(yǎng)條件為:光暗比 16 h∶8 h，光強為2 000 lx，(22±1)℃.試驗期間不喂食，持續(xù)48 h.試驗終點為死亡，即在體視鏡下觀察其心臟停止跳動.

1.3 大型溞慢性毒性試驗

慢性毒性試驗按照 OECD標準方法［9］進行.試驗容器為9 cm培養(yǎng)皿，試液體積為50 m L，每個培養(yǎng)皿中隨機放入1只溞齡小于24 h的新生健康幼溞，加蓋以防止受試液揮發(fā).根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果設置慢性毒性受試濃度組6組，每組6個平行.同時設一對照組.其中最高濃度組低于急性毒性LC50值.采用靜態(tài)更新試液法，每隔一天更新一次受試液.并加入一滴綠藻濃縮液〔斜生柵藻(Scenedesmaceae obliquus)〕，使試液中藻細胞密度達50×104m L-1以上，以喂食大型溞.試驗持續(xù)21 d，每天觀察記錄大型溞存活、脫殼、生長、懷孕和產(chǎn)仔情況.考察指標有:7 d體長，21 d體長，脫殼數(shù)，首次懷孕時間，首次產(chǎn)卵時間，首胎產(chǎn)卵量和每只母溞生殖期所產(chǎn)幼溞總數(shù)(平均值)等.

1.4 慢性子代急性毒性試驗

在大型溞慢性毒性試驗中，當母溞進入產(chǎn)卵高峰期時，搜集每個處理組懷孕母溞同一天所產(chǎn)且非第一代幼溞，用于測定氨氮對其的急性毒害.試驗方法同1.2節(jié)，考察受試子代對氨氮暴露的適應性變化.

1.5 質(zhì)量保證

為保證試驗結(jié)果的有效性，同時測定重鉻酸鉀對大型溞的24 hEC50值，為0.7 mg/L，滿足標準要求 (0.5～1.2 mg/L).整個試驗過程中ρ(溶解氧)＞5 mg/L.對照組沒有抑制現(xiàn)象.在試驗過程中采用納氏試劑分光光度法測定了受試液中氨氮實際含量，ρ()占設定濃度的85.0% ～109.3%，在 ±20%范圍內(nèi)，因此試驗采用設定濃度而未加以修正.

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有處理組數(shù)據(jù)用單樣本 K-S檢驗是否符合正態(tài)分布. 急性LC50值是根據(jù) Trimmed Spearman-Karber統(tǒng)計分析方法，使用 Trimmed Spearman-Karber(TSK)Program Version1.5［10］計算.慢性數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計分析軟件 SPSS16.0 for Windows分析各種指標與對照組差異，以獲得受試物對大型溞的慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL).然后根據(jù)這2個值求其幾何平均值得到受試物慢性毒性值(CHV)，并由此得到急慢性比(ACR).

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氮對大型溞的急性毒性效應

氨氮對大型溞的急性毒性試驗結(jié)果見表 1.對照組在試驗結(jié)束時未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，死亡率為0.由于氨氮對大型溞急性毒害范圍較大，死亡率隨時間變化很劇烈，24 h時150.00 mg/L濃度組死亡率只有15%，而到了48 h則全部死亡.因此分2組進行試驗，以便分別測定24 h和48 hLC50.24 h和48 h的毒性效應結(jié)果經(jīng)單樣本K-S檢驗，均符合正態(tài)分布(P＞0.05).采用TSK程序計算氨氮對大型溞的24 hLC50為165.97 mg/L，而48 hLC50為69.54 mg/L.由此可知，隨著暴露時間的延長，大型溞體質(zhì)明顯下降，對氨氮的耐受能力也大大減弱.推測原因是氨氮降低了大型溞的能量代謝活動，并使其呼吸困難，體內(nèi)輸氧能力減弱導致供氧不足而死亡.試驗過程中觀察到暴露于氨氮中的大型溞有大量脫皮，游動能力和頻率隨時間的持續(xù)而顯著降低.高濃度組則靜止，僅在搖動容器時有微弱擺動，暴露一定時間即死亡.在整個試驗中，大型溞運動受抑制數(shù)(EC)與死亡數(shù)(LC)相差不大.

表1 氨氮對大型溞的急性毒性試驗結(jié)果Table 1 The acute toxicity results of ammonia toD.magna

2.2 氨氮對大型溞的慢性毒性效應

氨氮對大型溞的慢性毒性試驗中各毒性指標隨氨氮濃度的變化見表2.在21 d慢性毒性試驗期間，對照組及各處理組中均沒有個體死亡.與對照組相比，各處理組首次懷孕時間和首次產(chǎn)卵時間均有所增大.這與 EBERT［11］報道的毒物會延遲大型溞種群開始繁殖時間的現(xiàn)象一致.但是可能由于試驗所設濃度的局限性等原因，這種差異性并不顯著(P＞0.05).隨著暴露濃度的增加，首胎產(chǎn)卵量略微增加，后又有所下降，ρ()達30.00 mg/L時，首胎產(chǎn)卵量與對照組相比增加了46%.平均每只母溞總產(chǎn)卵量除了7.50和15.00 mg/L的濃度組與對照組相比有顯著降低之外，其余各組均沒有顯著變化.對于該原因還需進一步研究探討.每只母溞21 d的脫皮數(shù)與其他指標相比，是一個較好的指標.各濃度組與對照組相比均有所降低，ρ()達3.75 mg/L及以上者均有顯著降低. 說明氨氮能抑制大型溞的脫皮. SMART［1］的研究表明，水中氨氮可降低水生生物的能量代謝活動，損害其各種器官組織.推測氨氮抑制大型溞脫皮的機理可能與此有關.

由表2可知，在考察濃度范圍內(nèi)，7 d體長、首次懷孕時間、首次產(chǎn)卵時間和21 d體長等4個指標與對照組在0.05顯著性水平上相比沒有顯著差異;首胎產(chǎn)卵量、每只母溞總產(chǎn)卵量和脫皮數(shù)等3個指標則有顯著性差異，說明是敏感指標，其中最敏感的指標是脫皮數(shù).由首胎產(chǎn)卵量、每只母溞總產(chǎn)卵量和脫皮數(shù)3個指標得出慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL)列于表3.

由脫皮數(shù)指標得出氨氮對大型溞的LCL和UCL分別為1.88和3.75 mg/L.取二者幾何平均值即氨氮對大型溞的CHV為2.66 mg/L，該值與急性48 hLC50之比得到ACR為26.14.

大型溞慢性毒性試驗一般進行21 d暴露，但是有研究［12-13］指出:在進行大型溞慢性毒性試驗時，大型溞早期(7～8 d)體長變化對環(huán)境因子較敏感，并提出以其早期的體長為試驗指標，可以縮短試驗周期.GEIGER等［14］也指出，水溞出生后的7 d內(nèi)，其生長受抑制可能是動物慢性試驗的良好指標.因此，筆者選擇7 d體長作為考察指標，以驗證該結(jié)論.但是試驗結(jié)果表明，7 d體長指標對于衡量氨氮對大型溞的毒害并不是敏感指標.因此，該指標的推廣和應用還需慎重考慮.另外，一些研究［15-17］指出，生殖指標是大型溞最敏感的指標.筆者所選的3個敏感指標中前2個即是生殖指標，說明對于衡量氨氮的毒性，生殖指標確是較敏感的指標.但從慢性試驗結(jié)果來看，脫皮數(shù)作為衡量大型溞生長情況的指標，對于考察氨氮的毒性卻是最敏感的.這些現(xiàn)象充分說明了大型溞的各生物學指標不僅對同一種藥劑的敏感性有所差別，對不同藥劑的反應模式也有所不同［18］.

表2 氨氮對大型溞的慢性毒性數(shù)據(jù)Table 2 The chronic toxicity of ammonia toD.magna

表3 氨氮對大型溞的慢性毒性試驗結(jié)果Table 3 The chronic toxicity results of ammonia toD.magna

根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，氨氮對大型溞的48 hLC50為69.54 mg/L，按照化學物質(zhì)對水生生物的急性毒性分級［19］，屬于低毒.但是其慢性毒性下限值為1.88 mg/L.說明氨氮對水生生物的長期慢性毒害不容忽視.

2.3 氨氮對慢性受試母溞所產(chǎn)子代的急性毒性效應

氨氮對慢性試驗中受試母溞所產(chǎn)子代的急性毒性效應結(jié)果見圖1.

在慢性試驗中，暴露于毒物的母體所產(chǎn)的子代幼溞，與對照組相比，其 48 hLC50都有所增大(增幅為13.7%～56.2%).暴露于30.00 mg/L濃度組的母溞所產(chǎn)幼溞的 48 hLC50增至 108.62 mg/L，為對照組的156.2%.說明出生于毒物暴露環(huán)境中的幼溞，對毒物的適應性都有增強，且在受試濃度范圍內(nèi)有上升的趨勢，ρ()為30.00 mg/L組的耐受性最強.EBERT［11］報道，毒物會延遲大型溞種群開始繁殖的時間，但是，當外界環(huán)境中污染物消失時，因受毒物影響延遲繁殖的母溞所生后代將會存活得更長并生長得更快.這說明大型溞對暴露毒物已經(jīng)產(chǎn)生了相當?shù)倪m應性. MUNZINGER等［20］也曾研究了鎳對大型溞7代的影響，發(fā)現(xiàn)長期在毒物中生存的大型溞由于產(chǎn)生了適應性，其內(nèi)稟增長率有所增加.對于可能在生物體內(nèi)積累的毒物，還需要進一步研究毒物是否從母代遺傳到子代，并且找到這種現(xiàn)象的原因，探討母代受污染后所產(chǎn)生的子代在生理學及能力方面的變化等問題也將具有重要的生物學意義.

圖1 慢性試驗中暴露于各處理組母溞所產(chǎn)子代48 h LC50值Fig.1 The 48 hLC50ofD.magnaoffspring born in each concentration of the chronic test

3 結(jié)論

a.氨氮對大型溞的 24 hLC50為 165.97 mg/L，48 hLC50為69.54 mg/L.按照化學物質(zhì)對水生生物的急性毒性分級標準，屬于低毒.

b.在氨氮暴露環(huán)境中，大型溞的首胎產(chǎn)卵量、每只母溞總產(chǎn)卵量和脫皮數(shù)3個指標為敏感指標.由此得到氨氮對大型溞的LCL和UCL分別為1.88和 3.75 mg/L，CHV為 2.66 mg/L，ACR為26.14.氨氮對大型溞的長期慢性毒害不容忽視.

c.在慢性毒性試驗中，暴露于氨氮的母溞所產(chǎn)的子代幼溞對氨氮的適應性都有增強，且在受試濃度范圍內(nèi)有增大趨勢.

［1］SMART G R.Investigations of the toxic mechanisms of ammonia t，o fish-gas exchange in rainbow trout(Salmo gairdneri)exposed to acutely lethal concentrations［J］.Journal of Fish Biology，1978，12(1):93-104.

［2］BOWER C E.Ionization of ammonia is sea water:effects of temperature，pH and salinity［J］.Journal of the Fisheries Research of Board of Canada，1978，35(7):1012-1016.

［3］HARMON S M，SPECHT W L，CHANDLER G T.A comparison of the daphnids Ceriodaphnia dubia and Daphnia ambigua for their utilization in routine toxicity testing in the Southeastern United States［J］.Arch Environ Contami Toxicol，2003，45:79-85.

［4］COOMAN K，DEBELSP，GAJARDO M，et al.Use of Daphnia spp.for the ecotoxicological assessment of water quality in an agricultural watershed in South-Central Chile［J］.Arch Environ Contami Toxicol，2005，48(2):191-200.

［5］TANYA C，HE W X，RAVI N，et al.Toxicity of chlorpyrifos and TCP alone and in combination to Daphnia carinata:the influence ofmicrobial degradation in natural water［J］.Water Res，2007，41(19):4497-4503.

［6］劉曉玲，羅義，周啟星.環(huán)境中兩種沐浴露污染對大型蚤的生態(tài)毒性效應［J］.環(huán)境科學學報，2008，28(6):1173-1177.

［7］黎艷霞，楊儉美.4種殺蟲藥劑對大型蚤(Daphnia magna)的毒性和酶活性影響的比較［J］.北京大學學報:自然科學版，1997，33(2):197-202.

［8］OECD.Guideline for testing of chemicals 202:Daphnia sp. acute immobilization test［S］.Paris，F(xiàn)rance:OECD，2004.

［9］OECD.Guideline for testing of chemicals 211:Daphniamagna reproduction test［S］.Paris，F(xiàn)rance:OECD，2008.

［10］US EPA.Dunnett program version1.5，probit program version 1.5 and trimmed Spearman-Karber(TSK)program version 1.5［Z］.Cincinnati，Ohio，USA:Ecological Monitoring Research Division，1990.

［11］EBERT D.The trade-off between offspring size and number in Daphnia magna:the influence of genetic，environmental and maternal effects［J］.Archive of Hydrobiology，1993，4(6): 453-473.

［12］樓宵.水生生物毒性試驗在工業(yè)廢水監(jiān)測中的應用研究［J］.中國環(huán)境監(jiān)測，1993(6):29.

［13］樓宵.水生生物毒性試驗的有關標準化問題探討［J］.環(huán)境監(jiān)測與管理技術，1993(2):26.

［14］GEIGER JG，BUIKEMA A L，CAIMS J J.A tentative seven day test for predicting effects of stress on population of Daphnia pulex［C］//EATON JG，PARRISH P R，HENDRICKS A C. Aquatic toxicology and hazard assessment.Philadelphia:3 rd Symposium，ASTM STP 707，1980:13-26.

［15］丁中海，路海天，劉冬姝，等.丙烯酰胺對大型蚤(Daphnia magna)的急性和慢性毒性［J］.農(nóng)村生態(tài)環(huán)境，2004，20 (2):65-67.

［16］YE W H，LIU W P，WEN Y Z，et al.Effects of bifenthrin on Daphnia magna during chronic toxicity test and the recovery test［J］.JEnviron Sci，2004，16(5):843-846.

［17］YIN D Q，JIN H J，YU LW，et al.Deriving freshwater quality criteria for 2，4-dichlorophenol for protection of aquatic life in China［J］.Environ Pollut，2003，122(2):217-222.

［18］劉少穎，朱國念，李少南.阿維菌素等幾種殺蟲劑對大型溞的慢性毒害［J］.農(nóng)藥科學與管理，2008，29(4):21-25.

［19］國家環(huán)境保護局.水生生物監(jiān)測手冊［M］.南京:東南大學出版社，1993:116-117.

［20］MUNZINGER A，MONICELLIF.Heavy metal co-tolerance in a chromium tolerant strain of Daphnia magna［J］.Aquatic Toxicology，1992，23(5):203-216.

Acute Toxicity o f Amm onia to O ffsp ring o f Daphnia m agna Born by Pregnant Individua ls During Chronic Exposure

ZHAO Zhi-gang，ZHANG Zhi-sheng，CHENG Jie，CHEN Chuan-bin，GAO Shi-xiang
State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，School of the Environment，Nanjing University，Nanjing 210046，China

X171.5

A

1001-6929(2011)02-0205-05

2010-06-19

2010-11-05

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2008ZX08526-003);國家高技術研究發(fā)展計劃(863)項目(2007AA06A405)

趙 志 剛 (1987 -)， 男， 山 東 臨 沂 人，xiaogang540@126.com.

*責任作者，高士祥(1962-)，男，江蘇揚州人，教授，博士，博導，主要從事污染生態(tài)化學研究，ecsxg@nju.edu.cn