HPLC法對細辛含藥血清中AAⅠ的含量測定

黃必勝，周禎祥，黃保希

1 儀器與試劑

1.1 儀器

戴安高效液相色譜儀：P680型輸液泵、在線脫水機、手動進樣器、TCC-100柱溫箱、PDA-100二極管陣列檢測器、chromeleon色譜工作站，戴安公司。

1.2 試劑

馬兜鈴酸A(AAⅠ)：中國藥品生物制品檢定所（批號：110746-200305)；甲醇（色譜純）：上海振興化工一廠；冰乙酸（分析純）：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；重蒸餾水、細辛含藥血清和空白含藥血清：由課題組提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：D i a m o n T M O D S-C 1 8(2 5 0 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-醋酸（72∶27∶1）；柱溫：室溫；檢測波長：390 nm；流速：1 mLmin-1。

2.2 AAⅠ對照品溶液、供試品溶液和空白血清組溶液的制備

精密稱取適量AAⅠ對照品8 mg，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制得AAⅠ對照品溶液，避光保存?zhèn)溆谩＞芰咳〖毿梁幯搴涂瞻籽甯?5 mg分別置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制得供試品溶液和空白對照組溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

取AAⅠ對照品溶液、供試品溶液及空白對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀按以上色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1～3。由圖1～3可知，AAⅠ的保留時間為16.833 min。

2.4 標準曲線的制備與線性考察

精密吸取AAⅠ對照品儲備溶液0.06 mL，0.12 mL，0.3 mL，0.6 mL，3 mL，6 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進樣為20 μL，記錄峰面積，以AAⅠ對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（見表1，圖4）。結(jié)果表明，AAⅠ峰面積在0.2～0.6 mgL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢測限為0.2 μgmL-1?；貧w方程為Y=7262.8X+2.4（r=0.9988，n=5）。

表1 AAⅠ對照品標準曲線測定峰面積

圖4 AAⅠ對照品標準曲線

2.5 精密度考察

精密吸取AAⅠ對照品溶液20 μL，進樣5次，得峰面積值的RSD=2.68%（n=5），結(jié)果表明儀器與色譜條件具有良好的精密度。結(jié)果見表2。

表2 精密度考察（n=5）

2.6 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液，在配制后0 h，4 h，8 h，12 h，16 h和24 h于同一色譜條件下分別進樣20 μL，所得峰面積值的RSD=2.38%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性考察（n=6）

2.7 加樣回收率考察

精密吸取供試品溶液10 mL平行6份，分成3組，每組2份，分別加入AAⅠ對照品溶液0.5 mL，1 mL及2 mL，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別進樣20 μL，記錄色譜圖。得出平均加樣回收率為100.02%，RSD=2.74%（n=6)。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率考察（n=6）

2.8 細辛含藥血清中AAⅠ含量測定

分別取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀分析，記錄峰面積，以外標法計算AAⅠ的含量，結(jié)果供試品中AAⅠ的含量低于最低檢測限，故忽略不計其具體含量（表10）。

表5 細辛含藥血清中AAⅠ含量測定(n=6)

3 討論與體會

馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）可引起腎臟損害的臨床報道和毒理研究已經(jīng)引起全世界的廣泛關(guān)注和高度重視。2000年5月，美國藥品與食品管理局（FDA）公布了含有AA的植物品種名單[1]，其中涉及17種中藥材，馬兜鈴科細辛屬細辛被列在名單之中。

AA可引起慢性腎臟損害，國外學者稱之為“中草藥腎病”（Chinese herbs nephropathy，CHN）[2]。國內(nèi)學者認為[3～6]，AA是引起CHN的主要毒性物質(zhì)，而含AA的僅限于馬兜鈴屬的少數(shù)藥物，并非所有中藥都會引起腎損害。因此，國內(nèi)學者提出“馬兜鈴酸腎病”（aristolochic acid nephropathy，AAN）這一概念，得到了國內(nèi)外學者的普遍認同。

AA類物質(zhì)是3，4-次甲二氧基-10硝基-1菲類衍生物，是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物所含的共有成分。AA主含AAⅠ，馬兜鈴酸B（AAⅡ）和馬兜鈴內(nèi)酞胺Ⅰ（ALⅠ）等，是目前公認的毒性成分，其中AAⅠ含量最高[8]。據(jù)報道[7]，AAⅠ對腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有一定的特征性，突出表現(xiàn)為細胞核的損傷。在急性AAN患者的腎活檢組織以及眾多AAN動物模型中發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞在發(fā)生急性損傷、壞死的同時并沒有出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。提示AAⅠ及其代謝產(chǎn)物在直接損傷細胞的同時，還抑制了細胞的增殖能力。李氏等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AAⅠ可致豬腎小管上皮細胞系LLC-PK1細胞DNA損傷，使細胞周期阻滯在G2/M期，認為這可能是AA腎損傷后腎小管上皮細胞再生修復能力差的機制之一。以上研究均表明，AAⅠ是AA造成腎損傷的主要毒性物質(zhì)。

相關(guān)文獻報道[10～11]，AAⅠ在細辛藥材特別是在其根及根莖中含量很低，甚至痕量，以至于薄層色譜對其檢測不到，而必須用靈敏度高的方法才能檢測到。本實驗用HPLC法檢測細辛含藥血清中AAⅠ，結(jié)果低于最低檢測限，說明細辛含藥血清中不含AAⅠ。因此，本研究認為，細辛雖屬馬兜鈴科植物，但在常規(guī)使用下，是有效、安全的，不會引起腎毒或腎損傷。

[1] 鮑志東,葉晨,黃欣.馬兜鈴屬植物的腎毒性[J].國外醫(yī)學中醫(yī)中藥分冊,2001,23(5):259.

[2] 孫偉.對中草藥腎毒性的理性探討[J].江蘇中醫(yī),2001,22(10):1.

[3] 諶貽璞,陳文.馬兜鈴酸腎病存在四種臨床病理類型[J].中華腎臟病雜志,2000,⑹:406.

[4] 康亞國,宋曉群.對中藥毒性問題的認識[J].陜西中醫(yī)學院學報,2001,24(3):51.

[5] 郭功玲,李吉華.對馬兜鈴酸腎病的新認識[J].上海中醫(yī)藥雜志,2003,37(1):33.

[6] 陳文,諶貽璞.馬兜鈴酸腎病的診斷與治療[J].醫(yī)師進修雜志,2003,26(5):11.

[7] 李恒,劉志紅,陳惠萍,等.馬兜鈴酸I對腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2001,10(3):242.

[8] WangYins,PanJing-xian,GaoJian-Jun,et al.The antitumor con hlentsfrom stem of Aristolochiamanshuriensis[J]. Beijing MeclUniv,2000,32(1):18.

[9] 李瑛,劉志紅,郭嘯華,等.馬兜鈴酸I致腎小管上皮細胞DNA損傷的實驗研究[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2004,13(1):7.

[10] 徐玫,李景華.細辛不同部位的馬兜鈴酸A及揮發(fā)油含量研究[J].藥物研究,2007,16(10):29.

[11] 黃順旺.北細辛中不含馬兜鈴酸A的薄層色譜法鑒別[J].安徽醫(yī)藥,2003,7(4):299.