趙慧芳，居正英，李維林，吳文龍，崔恩惠，屈樂文

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇南京210014)

黑莓果實(shí)多酚超聲提取工藝的響應(yīng)曲面優(yōu)化

趙慧芳，居正英，李維林*，吳文龍，崔恩惠，屈樂文

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇南京210014)

為了提高黑莓果實(shí)多酚的提取率，采用響應(yīng)曲面法對(duì)多酚超聲提取的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，建立了多酚超聲提取的總多酚和鞣花酸含量的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并分析了模型因子間的交互作用，驗(yàn)證了模型的有效性。結(jié)果表明，4因素對(duì)總多酚和鞣花酸提取的影響大小依次為乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間>超聲頻率，實(shí)驗(yàn)所得黑莓果實(shí)多酚超聲提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度為46.54%，料液比為1∶30，超聲頻率為24kHz，提取時(shí)間為33.68min，該條件下測(cè)得的黑莓果實(shí)總多酚含量為5.131mg·g－1，鞣花酸含量為0.1483mg·g－1。

黑莓，多酚，鞣花酸，超聲提取，響應(yīng)曲面

黑莓(Blackberry)為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus L.)植物，原產(chǎn)北美［1］，是新興第三代小果類果樹。黑莓果實(shí)柔嫩多汁、酸甜爽口、風(fēng)味獨(dú)特、色澤艷麗，其鮮果和加工產(chǎn)品受到歐美消費(fèi)者的青睞。江蘇省中國科學(xué)院植物研究所已與1986年開始黑莓引種與利用研究，至2006年已成功引進(jìn)了16個(gè)黑莓品種［2］。黑莓果實(shí)營養(yǎng)豐富，富含多酚類物質(zhì)，具有較 強(qiáng) 的 抗 氧 化［3］、清 除 自 由 基［4］、抗 癌［5］、抗 突變［6］、預(yù)防動(dòng)脈硬化等作用。研究表明黑莓果實(shí)的多酚類物質(zhì)包括五倍子酸、咖啡酸、阿魏酸、鞣花酸、兒茶酸、表兒茶酸、對(duì)香豆酸等，其中鞣花酸含量較高，約占總多酚含量的6%～10%［7］。據(jù)Ross H.A.等對(duì)樹莓果實(shí)鞣花酸提取物的研究，發(fā)現(xiàn)樹莓果實(shí)鞣花酸具有抗癌作用，對(duì)癌細(xì)胞具有防治作用［8］。因此，進(jìn)行黑莓果實(shí)多酚類物質(zhì)的開發(fā)和利用研究，具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑莓果實(shí)多酚的超聲提取工藝，以測(cè)得的果實(shí)總多酚和鞣花酸含量為考核指標(biāo)，研究了乙醇濃度、料液比、超聲頻率、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)黑莓果實(shí)多酚提取效果的影響，進(jìn)而確定了最佳提取工藝，對(duì)黑莓果實(shí)多酚類物質(zhì)的開發(fā)和利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑莓Boysen凍果 2009年6月4日采于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所黑莓品種園，－18℃速凍保存;沒食子酸、Folin－Ciocalteu’s試劑、碳酸鈉、乙醇、鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品 均為分析純。

WP 700TL23－k5Galanz微波爐，EX－200A 型電子天平，PHILIPS飛利浦?jǐn)嚢铏C(jī)HR2838，TU－1810紫外可見分光光度計(jì)，PL－5－B型低速離心機(jī)，KQ－100DE數(shù)控超聲波清洗儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 取黑莓凍果200g，微波解凍后打漿，精確稱取果漿4.000g于150m L錐形瓶中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件加入提取溶劑，進(jìn)行超聲提取，提取溫度為40℃;提取完成后，4000 r/m in離心10m in，取上清液定容至200m L，分別測(cè)定其總多酚和鞣花酸含量。

1.2.2 總多酚含量 Folin－Ciocalteu 法測(cè)定［9－10］。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取0.5000g沒食子酸，用純凈水溶解，并定容至1000m L，分別移取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、9.0、10.5、12.5、14.5m L 到 50m L容量瓶中，加水定容。分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0m L，加入 5.0m L 0.2mg·L－1Folin－Cioealteu’s試劑進(jìn)行混合;在0.5～8min內(nèi)，加入4m L 7.5%(w/v)飽和碳酸鈉溶液，充分混合。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在25℃下避光放置2h后，在765nm波長下測(cè)定吸光值。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程:y=0.01089x－0.23431，R2=0.9989。

1.2.2.2 樣品測(cè)定方法 樣品液稀釋4倍進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法同上，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品總多酚的含量。

1.2.3 黑莓果實(shí)鞣花酸含量測(cè)定［11－12］

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取0.1000g鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品用 35m L 0.1moL·L－1NaOH溶解，定容至1000m L，分別移取 0.5、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5m L 到100m L容量瓶中，加水定容。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定其在357nm下的吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，鞣花酸含量X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程:y=0.04044x+0.01324，R2=0.9960。

1.2.3.2 樣品含量測(cè)定 樣品液稀釋10倍后進(jìn)行測(cè)定，以水為空白，測(cè)定357nm下的吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品鞣花酸的含量。

1.2.4 黑莓果實(shí)多酚超聲提取的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定實(shí)驗(yàn)的因素與水平，應(yīng)用Design expert 7.0Trial設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇濃度、料液比、超聲頻率(以總功率的百分比記，超聲儀器總功率為40kHz)、提取時(shí)間4個(gè)因子為自變量，分別以X1、X2、X3、X4表示，以總多酚含量和鞣花酸含量為響應(yīng)值進(jìn)行分析［6－11］，分別以 Y1和 Y2表示。具體因素與水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)自變量因素編碼及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸分析

根據(jù)表1中的實(shí)驗(yàn)因素與水平的設(shè)計(jì)進(jìn)行了29次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸方程(模型)為:

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，由表3可以看出，總多酚含量 F回歸=13.62>［F0.05(14，4)=5.87］，P值＜0.0001表明模型極顯著;鞣花酸含量F回歸=9.85>［F0.05(14，4)=5.87］，P 值 ＜0.0001表明模型極顯著。總多酚含量F失擬=0.53≤［F0.05(14，10)=4.60］，失擬項(xiàng)P=0.8095>0.05，表明失擬不顯著;鞣花酸含量 F失擬=0.73 ＜ ［F0.05(14，10)=4.60］，失擬項(xiàng)P=0.6873>0.05，失擬也不顯著?？偠喾雍炕貧w模型的調(diào)整確定系數(shù)R=0.8632，說明該模型能解釋86.32%響應(yīng)值的變化，擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)超聲提取黑莓果實(shí)多酚類物質(zhì)進(jìn)行總多酚含量的分析和預(yù)測(cè);鞣花酸含量回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)R=0.8157，說明該模型能解釋81.57%響應(yīng)值的變化，模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)超聲提取黑莓果實(shí)多酚類物質(zhì)進(jìn)行鞣花酸含量的分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型方差分析

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4，總多酚含量模型中的一次項(xiàng)X1、X2和二次項(xiàng)0.0001)極顯著，一次項(xiàng)X3、交互項(xiàng)X2X4、二次項(xiàng)顯著;鞣花酸含量模型中的一次項(xiàng)X1、X2和二次項(xiàng)P＜0.0001)極顯著，二次項(xiàng)和X(P＜0.05)顯著。說明乙醇濃度和料液比對(duì)總多酚和鞣花酸的提取含量的主效應(yīng)明顯，且料液比和提取時(shí)間對(duì)總多酚含量有交互作用的影響。根據(jù)回歸系數(shù)估計(jì)值可知，影響因子的主效應(yīng)主次順序?yàn)?乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間>超聲頻率。

2.2 超聲提取黑莓果實(shí)多酚類物質(zhì)的響應(yīng)曲面分析與模型優(yōu)化

2.2.1 乙醇濃度和料液比對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響 從圖1可以看出，料液比不變，隨著乙醇濃度的增大，總多酚和鞣花酸的含量均呈增加趨勢(shì)，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到一定值，總多酚含量變化平緩，后繼呈現(xiàn)下降趨勢(shì);當(dāng)乙醇濃度恒定，料液比越高，多酚含量越高，且在乙醇濃度較低的區(qū)域，提高料液比有利于總多酚和鞣花酸含量的提高。

2.2.2 乙醇濃度和超聲頻率對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響 從圖2可以看出，超聲頻率不變，隨著乙醇濃度的增大，總多酚和鞣花酸含量呈增加趨勢(shì)，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%以上時(shí)，總多酚和鞣花酸含量變化平緩，后繼呈現(xiàn)下降趨勢(shì);當(dāng)乙醇濃度恒定，隨著超聲頻率的增大，總多酚和鞣花酸含量有小幅度增加，但當(dāng)超聲頻率達(dá)到60%以上時(shí)，總多酚和鞣花酸含量變化平緩，后繼呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖1 乙醇濃度與料液比對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響

2.2.3 乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響 從圖3可以看出，提取時(shí)間不變，隨著乙醇濃度的增大，總多酚和鞣花酸含量呈升高趨勢(shì)，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到35%～50%時(shí)，總多酚和鞣花酸含量變化平緩，乙醇濃度高于50%時(shí)略有下降;當(dāng)乙醇濃度恒定，隨著提取時(shí)間的延長，總多酚和鞣花酸含量逐漸增加，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到25min以上時(shí)，總多酚含量和鞣花酸含量變化平緩并略有下降趨勢(shì)。

圖2 乙醇濃度與超聲頻率對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響

圖3 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響

圖4 超聲頻率與料液比對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響

2.2.4 料液比和超聲頻率對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響 從圖4可以看出，超聲頻率不變，隨著料液比的增大，總多酚和鞣花酸含量呈升高趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25以上時(shí)，總多酚和鞣花酸含量變化平緩;當(dāng)料液比恒定，隨著超聲頻率的增大，總多酚和鞣花酸含量逐漸升高，前者升高的幅度顯著大于后者，總多酚含量在超聲頻率大于總功率的70%后變化平緩，而鞣花酸含量在超聲頻率大于總功率的70%后則略有下降。2.2.5 料液比和提取時(shí)間對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響 從圖5可以看出，提取時(shí)間不變，隨著料液比的增大，總多酚和鞣花酸含量呈升高趨勢(shì)，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶25之后，總多酚和鞣花酸含量變化平緩且略有下降，在提取時(shí)間較長的范圍內(nèi)提高料液比有利于總多酚和鞣花酸含量的提高;當(dāng)料液比恒定，隨著提取時(shí)間的延長，總多酚和鞣花酸含量逐漸增加，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到25min以上時(shí)，總多酚和鞣花酸含量變化平緩且后繼略有下降，在料液比較高的區(qū)域內(nèi)延長提取時(shí)間有利于總多酚和鞣花酸含量的提高。

圖5 料液比與提取時(shí)間對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響

2.2.6 超聲頻率和提取時(shí)間對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響 從圖6可以看出，提取時(shí)間不變，隨著超聲頻率的增大，總多酚和鞣花酸含量呈升高趨勢(shì)，但當(dāng)超聲頻率達(dá)到60%之后，總多酚和鞣花酸含量變化平緩，且后繼略有下降，在提取時(shí)間較短的范圍內(nèi)提高超聲頻率有利于總多酚含量的提高;當(dāng)超聲頻率恒定，隨著提取時(shí)間的延長，總多酚和鞣花酸含量逐漸增加，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30min以上時(shí)，總多酚含量變化平緩，而鞣花酸含量則略有下降，在超聲頻率較低的區(qū)域內(nèi)延長提取時(shí)間有利于總多酚和鞣花酸含量的提高。

圖6 超聲頻率與提取時(shí)間對(duì)總多酚和鞣花酸含量的影響

綜合圖1～圖6的變化規(guī)律可得出如下分析結(jié)果:a.在料液比、超聲頻率和提取時(shí)間不變的情況下，乙醇濃度選擇在40%～60%的范圍內(nèi)總多酚和鞣花酸含量較高;b.在乙醇濃度、超聲頻率和提取時(shí)間不變的情況下，料液比選擇在1∶25～1∶30范圍內(nèi)總多酚和鞣花酸含量較高;c.在乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間不變的情況下，超聲頻率在50%～80%的范圍內(nèi)總多酚和鞣花酸含量最高;d.在乙醇濃度、料液比和超聲頻率不變的情況下，提取時(shí)間在25～35min的范圍內(nèi)總多酚和鞣花酸含量最高。

根據(jù)回歸模型，超聲提取黑莓果實(shí)總多酚和鞣花酸的最佳條件為:X1=46.54，X2=30，X3=62.26，X4=33.68，此時(shí)Y1=5.313;轉(zhuǎn)化為實(shí)際參數(shù)，即在乙醇濃度46.54%，料液比1∶30，超聲頻率24kHz，提取時(shí)間33.68min的條件下，測(cè)得黑莓果實(shí)的總多酚含量高達(dá) 5.313mg·g－1，鞣花酸含量高達(dá) 0.1502mg·g－1。在該條件下，實(shí)驗(yàn)值Y1為5.131，Y2為0.1483，兩者與預(yù)測(cè)值相差均小于5%。

2.3 模型的檢驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定超聲提取黑莓果實(shí)多酚類物質(zhì)的最優(yōu)工藝條件，利用Design Expert分析，優(yōu)選出12組參數(shù)來驗(yàn)證。結(jié)果顯示總多酚含量的平均相對(duì)誤差為3.70% ±2.26%，鞣花酸含量的平均相對(duì)誤差為3.85% ±2.52%，均低于5%，證明該模型能較好地評(píng)價(jià)超聲法提取黑莓果實(shí)多酚的作用效果。

3 結(jié)論

超聲波提取是利用超聲波在液體中的空化、振動(dòng)、擴(kuò)散、擊碎等作用加速植物有效成分的浸出，具有溫度低、時(shí)間短、耗能低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，避免提取過程中因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化、損失及生理活性的降低，廣泛用于多種植物有效成分的提取。

本研究用超聲提取的方法，從黑莓果實(shí)中提取多酚類物質(zhì)，應(yīng)用響應(yīng)曲面法進(jìn)行分析，對(duì)自變量:乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、超聲頻率(X3)、提取時(shí)間(X4)等4因素與因變量:總多酚含量(Y1)和鞣花酸含量(Y2)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了回歸分析，數(shù)學(xué)模型極顯著相關(guān)。黑莓果實(shí)多酚類物質(zhì)的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度46.54%，料液比1∶30，超聲頻率24kHz，提取時(shí)間為33.68min，在此工藝條件下，測(cè)得黑莓果實(shí)的總多酚含量為5.131mg·g－1，鞣花酸含量為0.1483mg·g－1。經(jīng)檢驗(yàn)證明該提取黑莓果實(shí)多酚類物質(zhì)的工藝條件合理、可靠。

［1］吳文龍，顧姻.新經(jīng)濟(jì)植物黑莓的引種［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，1994，3(3):45－48.

［2］吳文龍，李維林，閭連飛，等.黑莓、樹莓在南京地區(qū)的引種研究［J］.江蘇林業(yè)科技，2006，33(2):13－15.

［3］Tate P，God J，Bibb R，et al.Inhibition of metalloproteinase activity by fruit extracts ［J］.Cancer Letters，2004，212:153－158.

［4］Seeram1N P，Momin1R A，Nair M G，et al.Cyclooxygenase inhibitory and antioxidant cyaniding glycosides in cherries and berries ［J］.Phytomedicine，2001，8(5):362－369.

［5］Boateng J，Verghese M，Shackelford L，et al.Selected fruits reduce azoxymethane(AOM)－induced aberrant crypt foci(ACF)in Fisher344male rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2007，45:725－732.

［6］Elisia I，Hu C，Popovich D G，etal.Antioxidantassessment of an anthocyanin－enriched blackberry extract［J］.Food Chemistry，2007，101:1052－1058.

［7］Sellappan S，Casimir C Akhon，Krewer G.Phenolic Compounds and Antioxidant Capacity of Georgia－Grown Blueberries and Blackberries ［J］.Agricultural Food Chemistry，2002，50:2432－2438.

［8］Ross H A，McDougall G J，Stewart D.Antiproliferative activity is predominantly associated with ellagitannins in raspberry extracts［J］.Phytochemistry，2007，68:218－228.

［9］Singleton V L，Rossi JA.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic－phosphotungstic acid reagents ［J］.American Journal of Enology and Viticulture，1965，16:144－158.

［10］李靜，聶繼云，李海飛，等.Folin－酚法測(cè)定水果及其制品中總多酚含量的條件［J］.果樹學(xué)報(bào)，2008，25(1):126－131.

［11］陳笳鴻，吳冬梅，汪詠梅，等.紫外分光光度法測(cè)定鞣花酸含量的研究［J］.生物質(zhì)化學(xué)工程，2001，41(3):18－20.

［12］晉艷曦.葡萄汁中鞣花酸的定性與定量分析［J］.飲料工業(yè)，1995，2(5):33－36.

Optim ization of ultrasonic extraction process of polyphenols from blackberry fruit by using response surface analysis

ZHAO Hui－fang，JU Zheng－ying，LIW ei－lin*，WU W en－long，CUIEn－h(huán)ui，QU Le－wen
(Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China)

Response surfacem ethodology was adopted to study the optim ized param eters in order to increase the yield of blackberry fruit polyphenol.The m odels of second order quadratic equation for total polyphenol and ellagic acid contentwere built.The interaction involved factorswere analyzed，and adequacy of themodel equations for predicting the optimum response values was verified.The results indicated that the effect orders of four factors on polyphenol yield were as follow:ethanol concentration，solid－liquid ratio，extraction time and ultrasonic frequency.The optim ized technology parameters were ethanol concentration of 46.54%，solid－liquid ratio of 1∶30，ultrasonic frequency of 24kHz，extraction time of 33.68m in，and under these conditions the content of total polyphenol was up to 5.131mg·g－1，the content of ellagic acid was up to 0.1483mg·g－1.

blackberry;polyphenol;ellagic acid;ultrasonic extraction;response surfacemethodology

TS201.1

B

1002－0306(2010)06－0299－05

2010－06－01 *通訊聯(lián)系人

趙慧芳(1984－)，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事黑莓等植物功能性營養(yǎng)物質(zhì)的研究與利用。

江蘇省農(nóng)業(yè)高科技項(xiàng)目(BG2007311);江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(BM2009041)。