張 曦，金 芬，*，錢永忠，*，于志勇，王 靜

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全重點實驗室，北京100081;2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，國家水質(zhì)學(xué)重點實驗室，北京100085)

高效液相色譜
——串聯(lián)譜法測定櫻桃番茄中四種季銨類農(nóng)藥

張 曦1，金 芬1，*，錢永忠1，*，于志勇2，王 靜1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全重點實驗室，北京100081;2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，國家水質(zhì)學(xué)重點實驗室，北京100085)

建立了4種季銨類農(nóng)藥(矮壯素、燕麥枯、敵草快和縮節(jié)胺)的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(LC－MS/MS)檢測方法。樣品用75%乙腈－水溶液提取，高速離心后取上清液過尼龍濾膜，用親水柱分離，以含0.1%甲酸的水∶乙腈=25∶75(V∶V)作為流動相，在正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下進行測定。4種季銨類農(nóng)藥的線性范圍為0.5～100ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)在0.9982～0.9996范圍內(nèi)，方法檢出限為0.005mg/kg，可以滿足國際限量的要求。在0.04、0.08、0.16mg/kg添加濃度下，4種季銨類農(nóng)藥的回收率為91.4%～106.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于15%。本方法可用于櫻桃番茄樣品中4種季銨類農(nóng)藥的測定。

季銨化合物，農(nóng)藥，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，櫻桃番茄

季銨類化合物作為除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用，常見的季銨類農(nóng)藥包括燕麥枯(Difenzoquat，DF)、敵草快(Diquat，DQ)、矮壯素(Chlormequat，CQ)和縮節(jié)胺(Mepiquat，MQ)等(結(jié)構(gòu)見圖1)。敵草快對生物體的氧化還原活性影響很大，如肺、心、肝、腎等均有不同程度的傷害，世界衛(wèi)生組織將敵草快和燕麥枯歸為中等毒性［1］。近年來有研究表明矮壯素可能對動物的繁殖能力有影響，因此被列為疑似內(nèi)分泌干擾物［2－3］。為此，許多國家對該類農(nóng)藥都有嚴(yán)格的檢驗要求和規(guī)定，如歐盟規(guī)定番茄中敵草快和矮壯素為0.05mg/kg［4］，而日本規(guī)定矮壯素和燕麥枯為0.05mg/kg，縮節(jié)胺則為一律標(biāo)準(zhǔn)0.01mg/kg［5］。由于季銨類農(nóng)藥在低pH條件下完全電離，以陽離子形式存在，普通的C18柱對其無法保留，所以對季銨類農(nóng)藥殘留分析的報道較少。已報道的研究有馬鈴薯中的敵草快［6］，水中的敵草快和百草枯［7－9］，番茄及番茄醬中的矮壯素和縮節(jié)胺［10］，糧谷中的矮壯素［11］以及土壤中的矮壯素［12－13］的測定等。目前，主要采用基于不同色譜分離機理(如C18柱、苯基柱及離子交換柱)的液相色譜－質(zhì)譜法測定季銨類農(nóng)藥。雖然目前離子對色譜法是眾多國家推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法，但由于其在流動相中添加離子對試劑會對質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染，抑制負(fù)離子模式下的信號［14－15］，所以該方法不適用于檢測矮壯素、縮節(jié)胺等物質(zhì)。目前，利用親水色譜柱分析食品中季銨類農(nóng)藥的種類還很少，還沒有能夠同時測定敵草快、燕麥枯、矮壯素及縮節(jié)胺4種季銨類農(nóng)藥的液相色譜－質(zhì)譜法。為此，本研究建立了采用親水柱的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定櫻桃番茄中4種季銨類農(nóng)藥的分析方法。

表1 四種季銨類農(nóng)藥的質(zhì)譜條件參數(shù)

圖1 四種季銨類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

矮 壯 素 (ChlormequatChloride，CQ，99% ±0.5%)、敵草快(diquat dibromide hydrate，DQ，98%)、燕麥枯(difenzoquat methyl sulfate，DF，99%)、縮節(jié)胺(Mepiquat Chloride，MQ，99% ±0.5%) 4 種標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Labor Dr.Ehrenstorfer－Schafers公司;甲醇、乙腈 色譜純，德國Merck;甲酸 96%，美國DIMA公司;超純水;其余試劑 均為分析純。

高效液相色譜儀 Aglient 1200，美國安捷倫公司;質(zhì)譜 API2000，美國 AB公司;高速分散機

T18，德國IKA;離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;超純水機 Millipore，美國Millipore公司;尼龍濾膜(0.2μm)。

1.2 樣品預(yù)處理

選取一定數(shù)量有代表性的樣品，切碎，于榨汁機中搗碎，均勻分散，稱取搗碎試樣5g(準(zhǔn)確至0.01g)于50mL聚丙烯離心管中，加入適量的超純水，使得試樣中的水與超純水的總量為10mL，加入30mL乙腈。在高速勻漿機上勻漿2min，將高速勻漿后的樣品于9000r/min下離心5min。吸取1～2mL上述離心液上清液，過0.2μm尼龍濾膜。將濾液收集于1.8mL樣品瓶內(nèi)，用于測定。

1.3 色譜條件

色譜柱:Atlantis HILIC Silica，150mm ×2.1mm(i.d.)，粒徑 3μm;柱溫:40℃;進樣體積:10μL;流動相:含 0.1% 甲酸的水∶乙腈 =25∶75(V∶V)，流速:0.2mL/min。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源(Ion Source):電噴霧離子源(Turbo IonSpray，TIS)，正離子掃描方式;離子源溫度(Temperature，TEM):500℃;氣簾氣壓力(Curtaingas，CUR):30V;離子噴霧電壓(IonSpray Voltage):5500V;霧化氣壓力(Gas1):50psi;加熱輔助氣壓力(Gas2):55psi;碰撞氣壓力(Collisiongas):4V;駐留時間:200ms。矮壯素和縮節(jié)胺質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的確定

矮壯素(CQ)、縮節(jié)胺(MQ)和燕麥枯(DF)進入一級質(zhì)譜后，很容易產(chǎn)生穩(wěn)定的［M］+，m/z分別為112、114、249。［M］+離子作為母離子進入二級質(zhì)譜后發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同碎片離子，CQ產(chǎn)生有顯著豐度的m/z 58.1及63.1離子碎片，MQ產(chǎn)生m/z 58.1和98.2的離子碎片，DF產(chǎn)生m/z 118.0及193.1離子碎片。CQ、MQ和DF的定量離子分別選擇豐度較高的m/z 63.1，58.1和118.0碎片離子，這與現(xiàn)有的文獻報道相一致［16－18］。而DQ進入質(zhì)譜后產(chǎn)生較穩(wěn)定的［M－H］+，［M－H］+離子作為母離子產(chǎn)生碎片離子 m/z 157和78。其中 m/z 157為［M－C2H3］+豐度最高，作為定量離子。

碰撞能量(Collision Energy，CE)是影響碎片離子分布的最重要因素之一，如果CE能量過高，會產(chǎn)生很多小的碎片，造成碎片信息過多過雜，有時對于某些化合物，很高的CE會產(chǎn)生很差的質(zhì)譜圖;而CE能量過低，會造成結(jié)構(gòu)信息不足等。在多離子監(jiān)測(MRM)模式下，可以針對每一對離子進行優(yōu)化。如圖2所示，CQ、MQ和DF在較低的CE值(29～42V)下，每個子離子即可達到最高響應(yīng)。但對于DQ來說，在 CE 為57V 的條件下，m/z 78［M－C2H3］2+的響應(yīng)比m/z 157［M－CH4］+高3倍，所以在 DQ定量離子選擇157>78。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

與甲醇相比，乙腈作為流動相能獲得較低的柱壓和較高的響應(yīng)值，故本實驗選擇乙腈作為流動相的有機相。為了獲得較高的靈敏度和分離效果，本實驗比較了不同流動相配比對4種季銨類農(nóng)藥的分離與靈敏度的影響。如圖3所示，乙腈的比例越高，4種季銨類農(nóng)藥在柱上的保留越強，但峰寬也越大，這就給樣品的定量帶來困難。此外，乙腈比例為75%時靈敏度最高。因此，綜合考慮靈敏度與分析速度，本實驗選擇了乙腈和水相比例為75∶25，作為定量分析的色譜條件。

圖2 不同CE值條件下四種季銨類農(nóng)藥碎片的離子強度注:a－MQ;b－CQ;c－DQ;d－DF。

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1 提取液的優(yōu)化 季銨類化合物的強極性結(jié)構(gòu)決定了其易溶于水的性質(zhì)，因此選擇75%乙腈－水溶液，67%乙腈－水溶液和100%水溶液，分別對加標(biāo)果蔬樣品中4種季銨類農(nóng)藥進行了提取。在該三種提取液中，4種季銨類農(nóng)藥的回收率均能滿足要求，其中100%水溶液為75%～79%，75%乙腈－水溶液為83%～84%，67%乙腈－水溶液為71%～77%(圖4)?？紤]到75%乙腈－水溶液的提取液與液相條件中的流動相配比相同，而其他兩種提取液如果在直接進樣后會由于溶劑效應(yīng)的影響而造成峰拖尾或變寬，所以必須在進行前重新用流動相轉(zhuǎn)溶，這就增大了結(jié)果的誤差且降低了方法的靈敏度，因此，本實驗選擇75%乙腈－水溶液作為提取液。

2.3.2 提取液用量的確定 不同提取液用量對季銨類農(nóng)藥的回收率也有較大影響，本研究比較了20、40、50mL三個不同體積提取液用量對回收率的影響(表2)。由于櫻桃番茄本身含水量較高，當(dāng)提取液體積為20mL時，達不到有機相和水相比例為3/1;而當(dāng)提取液體積為50mL時，櫻桃番茄樣品和提取液幾乎充滿整個離心管，在離心過程中溶液容易從離心管中漏出，污染離心機且影響回收率的結(jié)果。綜合考慮操作的可行性與回收率效果的影響，本方法確定40mL為提取液的體積。

圖3 不同流動相配比條件下四種季銨類農(nóng)藥的靈敏度和分離效果

圖4 不同組成提取液的提取效果

2.4 線性范圍、檢出限、回收率和精密度

用基質(zhì)加標(biāo)樣品 0.5、1、5、10、20、50、100ng/mL作為工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在上述色譜－質(zhì)譜條件下，得到4種季銨類農(nóng)藥的濃度與峰面積的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)見表3。

在櫻桃番茄樣品中添加濃度分別為0.04、0.08、0.16mg/kg的四種季銨類農(nóng)藥的回收率為91.7%～106.3%，相對偏差在1.5%～12.5%范圍內(nèi)，具體數(shù)據(jù)見表4。以10倍信噪比計算求得4種季銨類農(nóng)藥的儀器檢出限分別為0.05～0.2μg/kg;而方法檢出限為0.005mg/kg，能夠滿足目前國際限量的要求。

2.5 實際樣品的測定

利用上述所建立的分析方法，對北京市水果批發(fā)市場及超市中50個批次的櫻桃番茄樣品進行了分析，結(jié)果表明，其中34個批次的櫻桃番茄中含有矮壯素，濃度范圍在0.01～9.4mg/kg，6個批次的樣品中含有縮節(jié)胺，濃度范圍在0.01～0.38mg/kg，而只有1個批次的樣品中檢出DQ和DF，分別為0.01和0.04mg/kg。

表2 不同提取液體積的提取效果

表3 四種季銨類農(nóng)藥的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表4 櫻桃番茄中4種季銨類農(nóng)藥的加標(biāo)回收率(%)及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)

3 結(jié)論

本研究采用親水色譜柱，避免了離子對試劑的使用，克服了由于離子對試劑污染質(zhì)譜負(fù)離子模式的缺點，建立了同時測定櫻桃番茄中敵草快、燕麥枯、矮壯素和縮節(jié)銨四種季銨類農(nóng)藥的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法靈敏度高，能夠滿足國際限量的要求。

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Simultaneous determination of quaternary ammonium compounds in tomato by liquid chromatography－tandem mass spectrometry

ZHANG Xi1，JIN Fen1，*，QIAN Yong－zhong1，*，YU Zhi－yong2，WANG Jing1
(1.Key Lab of Agro－product Quality and Safety，Institute of Quality Standards ＆ Testing Technology for Agro－products，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China;2.State Key Lab of Environmental Aquatic Chemistry，
Research Center for Eco－Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085，China)

A method for the simultaneously determination of four representative quaternary ammonium compounds［chlormequat(CQ)chloride，mepiquat(MQ)chloride，deiquat(DQ)dibromide hydrate and difenzoquat(DF)methyl sulfate］，using liquid chromatography－tandem mass spectrometry(LC－MS/MS)system was developed.The chromatographic separation was performed using a hydrophilic interaction liquid chromatography(HILIC)column to avoid LC－MS system contamination with the use of ion－pair reagents.Aqueous solution containing 0.1%formic acid(A)and acetonitrile(B)(75 ∶25，V/V)were used as the mobile phasegavegood chromatographic retention and sensitivity for these four quaternary ammonium compounds(QACs).The recovery was 91.4%～106.3%for the four QACs at three concentration levels.The limit of quantitation(LOQ)for the four QACs in tomato samples were 0.005mg/kg based on the lowest spiked concentration with suitable precision and accuracy.Finally，the method was successfully used to detect residual QACs in cherry－tomatoes.

quaternary ammonium compounds;pesticides;LC－MS/MS;cherry－tomatoes

TS207.5+3

A

1002－0306(2011)06－0394－04

2010－04－14 *通訊聯(lián)系人

張曦(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:食品安全與檢測技術(shù)。

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(0032007228);2008年農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目資助。