魚皮明膠的超高壓輔助提取工藝

張宇昊，馬 良，師 萱

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716；3.重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司，重慶 401121)

魚皮明膠的超高壓輔助提取工藝

張宇昊1,2，馬 良1,2，師 萱3

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716；3.重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司，重慶 401121)

為建立魚皮明膠清潔生產(chǎn)工藝，對超高壓輔助提取魚皮明膠進(jìn)行系統(tǒng)研究，考察超高壓處理壓力、超高壓作用時間、提取溫度、提取時間對凝膠強(qiáng)度和提取率的影響。結(jié)果表明，較優(yōu)提取工藝為處理壓力300MPa、超高壓時間10min、提取溫度50～60℃、提取時間4h，在此條件下明膠凝膠強(qiáng)度可達(dá)274g，得率可達(dá)75.03%，溶解溫度和凝膠溫度分別為23.6℃和16.4℃。

超高壓；魚皮明膠；凝膠強(qiáng)度；得率

明膠是一種重要的生物大分子材料，以其溶膠-凝膠的熱可逆性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、感光材料、化工等領(lǐng)域[1]。通常明膠主要以豬、牛等哺乳動物的皮與骨為原料制備而成[2]。近年來，隨著瘋牛病、口蹄疫等危機(jī)的出現(xiàn)，不少國家禁止或減少了豬、牛來源明膠的生產(chǎn)和使用，源于水產(chǎn)類的明膠產(chǎn)品成為了研究的熱點。

目前對于魚皮明膠的研究主要集中在功能特性方面[3-7]，在制備工藝方面則主要沿用了哺乳動物明膠的制備工藝。這些傳統(tǒng)明膠制備工藝存在著生產(chǎn)周期長、水電資源消耗大、酸堿廢液排放量大、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點，已經(jīng)遠(yuǎn)不能適應(yīng)當(dāng)前國家節(jié)能減排的要求。

超高壓技術(shù)是在一定溫度下，將食品加壓100～1000MPa后保持一段時間，達(dá)到殺菌、滅酶和改善食品功能特性的加工技術(shù)。超高壓處理可以破壞蛋白質(zhì)的三、四級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響[8]。研究表明[9]采用100～500MPa的高壓作用可增強(qiáng)蛋白的凝膠特性，并能增加凝膠強(qiáng)度；尤其是在熱加工前對蛋白進(jìn)行高壓處理可促進(jìn)熱凝膠的形成，增強(qiáng)熱凝膠的強(qiáng)度。Gó mez-Guillé n等[10]曾采用超高壓制備魚皮明膠，其研究表明熱處理之前采用適當(dāng)?shù)某邏侯A(yù)處理可增加產(chǎn)品得率，且壓力的大小和時間會對明膠結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，進(jìn)而影響產(chǎn)品性質(zhì)，其認(rèn)為高壓可誘導(dǎo)蛋白聚合度增加，增加明膠中高相對分子質(zhì)量組分，進(jìn)而增加產(chǎn)品的凝膠特性。

以上研究均表明，超高壓技術(shù)可以破壞蛋白質(zhì)非共價鍵結(jié)構(gòu)，而明膠制備過程中采用酸堿前處理的目的之一也是破壞膠原蛋白三、四級結(jié)構(gòu)，因此，采用超高壓技術(shù)取代傳統(tǒng)的酸堿對膠原蛋白進(jìn)行前處理具有一定可行性。此外，超高壓處理可促進(jìn)蛋白聚合的特性更有利于高凝膠強(qiáng)度明膠的制備。本研究擬建立超高壓技術(shù)制備高凝膠強(qiáng)度魚皮明膠生產(chǎn)工藝，并對其凝膠特性進(jìn)行研究，旨在為改善明膠行業(yè)高污染現(xiàn)狀，建立魚皮明膠清潔生產(chǎn)工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

巴沙魚皮由重慶禾瑞康動物營養(yǎng)有限公司提供，原料獲取后除去雜質(zhì)，冷藏于冰箱中。

異丙醇、鹽酸、氯化鈉、對二甲氨基苯甲醛、石油醚(30～60℃) 重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；高氯酸成都金山化學(xué)試劑公司；氯胺T、羥脯氨酸 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-Xtzi物性測定儀 英國TA公司；HPB.A2超高壓生物處理實驗機(jī) 天津市華泰森淼公司；CS501-SP超級恒溫水浴 重慶四達(dá)儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵、800C離心機(jī)、85-2恒溫磁力攪拌器 重慶市春鑫科技有限公司；DGF3002BN電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 重慶恒達(dá)儀器廠；JY-10001電子天平 重慶法蘭朵科技發(fā)展有限公司；ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；L-8800型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；MCR301旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar公司。

1.3 分析方法

1.3.1 巴沙魚皮基本成分測定

水分含量：依照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》進(jìn)行測定；脂肪含量：依照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》進(jìn)行測定；蛋白質(zhì)含量：依照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白的測定》進(jìn)行測定；灰分含量：依照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》進(jìn)行測定；膠原蛋白測定(以羥脯氨酸計)：按照ISO 3496:1978(E)《Meat and meat products: Determination ofL(-)- hydroxyproline content》方法，測定羥脯氨酸。

1.3.2 明膠提取率

1.3.3 凝膠強(qiáng)度測定

質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.67%的明膠溶液在7℃凝凍18h，采用物性測定儀進(jìn)行測定。測定條件為下壓高度4mm、下壓速度1mm/s。

1.3.4 明膠氨基酸分析

采用6mol/L鹽酸110℃條件下水解22h，稀釋、過濾后上樣分析，分析條件為(1)分離柱：洗脫液流速0.4mL/min、柱溫700℃、柱壓9.627MPa；(2)反應(yīng)柱：茚三酮及茚三酮緩沖液流速0.35mL/min、柱溫1350℃、柱壓0.982MPa。

1.3.5 明膠溶解溫度與凝膠溫度測定

分別經(jīng)冷卻(40→5℃)和加熱(5→40℃)兩個溫度變化階段，溫度掃描速率為1.0℃/min，頻率1Hz，振蕩應(yīng)力3.0Pa。明膠黏彈性變化以相角(δ)與溫度的函數(shù)表示。

1.4 魚皮明膠的提取

1.4.1 明膠提取的工藝

工藝流程：魚皮→清洗、去雜質(zhì)、瀝干→脫脂→雜蛋白去除→清洗→超高壓處理→打漿→提膠→離心→干燥→成品明膠。

脫脂：采用石油醚回流脫脂8h、60℃、30min干燥。

雜蛋白去除：采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% NaCl溶液浸泡攪拌1 h。

1.4.2 單因素試驗設(shè)計

巴沙魚皮明膠單因素試驗的基本條件定為超高壓處理壓力300MPa、超高壓時間20min、提取溫度60℃、提取時間4h。改變其中一個條件，固定其他條件以分析超高壓壓力、超高壓時間、提取溫度、提取時間對明膠凝膠強(qiáng)度和得率的影響。各因素梯度分別為超高壓壓力：0.1、100、200、300、400、500MPa；超高壓時間：0、5、10、20、30 min；提取溫度：30、4 0、5 0、6 0、7 0℃；提取時間：0.5、1、2、4、6h。每個因素重復(fù)實驗3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚皮組成

表1 巴沙魚皮主要成分(以干基計)Table 1 Major components of Basa fish skin

從表1可看出，巴沙魚皮的膠原蛋白含量較高，是提取明膠較為理想的原料。同時魚皮中含有一定數(shù)量的脂肪，如不除去將對明膠的透明度產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響明膠質(zhì)量。本實驗采用石油醚回流12h的方法除去魚皮中的絕大部分脂肪。

2.2 超高壓制備魚皮明膠工藝條件的確定

2.2.1 超高壓壓力

由圖1可看出，在0～300MPa范圍內(nèi)隨著處理壓力的升高，凝膠強(qiáng)度呈上升趨勢，300MPa時達(dá)到282g，極顯著高于200MPa(P＜0.01)時的凝膠強(qiáng)度。但隨著處理壓力的繼續(xù)升高，作用壓力對于凝膠強(qiáng)度變化無顯著影響(P＞0.05)。明膠得率在不同處理壓力下無明顯變化規(guī)律，但超高壓作用可增加明膠得率，相對于未經(jīng)超高壓處理的樣品，100～500MPa范圍內(nèi)經(jīng)不同壓力處理的樣品，明膠提取率增長幅度為10.62%～15.62%。

圖1 壓力對明膠凝膠強(qiáng)度及得率的影響Fig.1 Effect of ultra-high pressure treatment pressure on gel strength and yield of gelatin

許多蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象是由一些非共價鍵的相互作用來穩(wěn)定的，高壓處理會破壞其非共價鍵平衡從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)改變[11]，這也是超高壓可以增加明膠提取率的原因所在。此外，研究[12]表明，對膠原蛋白實施超高壓處理可促使其分子聚合，而以此類膠原蛋白作為明膠提取原料，更有利于產(chǎn)品中形成大量的高分子聚合體，較多高分子量組分的存在則是形成高凝膠強(qiáng)度明膠的關(guān)鍵因素。實驗結(jié)果表明，當(dāng)壓力小于300MPa時，隨著壓力的增加，膠原蛋白分子聚合度可能逐漸增大，而當(dāng)壓力大于300MPa時，壓力的增加對于膠原蛋白分子聚合度的影響已經(jīng)不顯著。因此，確定較適壓力水平為300MPa。

2.2.2 超高壓時間

圖2 超高壓時間對明膠凝膠強(qiáng)度及得率的影響Fig.2 Effect of ultra-high pressure treatment time on gel strength and yield of gelatin

由圖2可看出，在0～10min范圍內(nèi)，隨著超高壓作用時間的延長明膠凝膠強(qiáng)度呈上升趨勢，超高壓處理10min后提取的樣品，凝膠強(qiáng)度可達(dá)274.1g。但當(dāng)超過10min后，超高壓作用時間對樣品凝膠強(qiáng)度變化無顯著影響(P＞0.05)。研究[13]表明，超高壓作用可以促進(jìn)蛋白亞基的聚凝，但短時超高壓處理利于增進(jìn)蛋白聚合，但當(dāng)?shù)鞍拙酆线_(dá)到一定程度時，繼續(xù)增加超高壓處理時間對于增進(jìn)蛋白聚合貢獻(xiàn)已經(jīng)很小。實驗結(jié)果表明，超過10min后超高壓作用對樣品凝膠強(qiáng)度變化無顯著影響，原因在于超高壓作用超過10min時，其對膠原蛋白的聚合度影響已經(jīng)很小。

樣品在300MPa超高壓下作用5～30min可顯著增加明膠得率(P＜0.05)，但明膠得率在超高壓10min時出現(xiàn)拐點，超高壓作用10min時明膠得率可達(dá)75.03%，當(dāng)超高壓時間超過10min后，得率呈下降趨勢。Gó mez-Guillé n等研究表明[10]，在250MPa壓力下，當(dāng)作用時間從10min延長到20min時，明膠提取率有所下降。這可能是因為在超高壓作用一段時間后，膠原蛋白形成了新的價鍵平衡，從而導(dǎo)致提取率降低。綜合研究結(jié)果，確定較適超高壓作用時間為10min。

2.2.3 提取溫度

圖3 提取溫度對明膠凝膠強(qiáng)度和得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on gel strength and yield of gelatin

由圖3可看出，當(dāng)提取溫度50℃時，明膠凝膠強(qiáng)度達(dá)到285.5g，明膠得率為71.15%，兩項指標(biāo)均極顯著高于40℃條件下提取的明膠(P＜0.01)；隨著溫度的進(jìn)一步提高，明膠凝膠強(qiáng)度呈下降趨勢，尤其是當(dāng)提取溫度達(dá)到70℃后，凝膠強(qiáng)度極顯著下降(P＜0.01)；而明膠提取率則隨溫度升高呈略微提高趨勢。

加熱可以斷開膠原分子三螺旋結(jié)構(gòu)的次級鍵及部分肽鍵，使膠原分子的單鏈、少量聚集體和單鏈斷裂組分進(jìn)入溶液，溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z。較低溫度提取明膠產(chǎn)率較低、提取時間長；適宜高溫提取可加速膠原轉(zhuǎn)化為明膠，但溫度過高，不僅不能進(jìn)一步提高產(chǎn)品得率，還會促使膠原過度降解，使明膠凝膠強(qiáng)度降低[14]。由試驗結(jié)果可推斷，30～40℃范圍內(nèi)明膠凝膠強(qiáng)度較低，這可能是由于超高壓促使膠原蛋白聚合，而這一溫度范圍內(nèi)其加熱強(qiáng)度較低，不足以通過水解并釋放這些聚合物，從而導(dǎo)致明膠中高分子組分比例較低，而隨著溫度上升，聚合物被釋放，進(jìn)而導(dǎo)致明膠凝膠強(qiáng)度增大。由此可見，提取溫度較適范圍為50～60℃。

2.2.4 提取時間

圖4 提取時間對明膠凝膠強(qiáng)度和得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on gel strength and yield of gelatin

由圖4可看出，4h以內(nèi)，隨著提取時間的延長，明膠凝膠強(qiáng)度無顯著差異(P＞0.05)，明膠得率則隨提膠時間的延長迅速上升，4h時明膠凝膠強(qiáng)度為282.2g，明膠提取率達(dá)到72.15%。隨著提膠時間的進(jìn)一步延長，明膠凝膠強(qiáng)度極顯著下降(P＜0.01)，得率則無顯著變化(P＞0.05)。明膠提取時間過短，膠液濃度太低，會影響產(chǎn)率；提膠時間過長會引起明膠過度水解，使明膠產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度降低。綜合以上因素，明膠較適提取時間在4h左右。

綜合以上結(jié)果確定超高壓法制備魚皮明膠較適工藝參數(shù)為超高壓壓力300MPa、超高壓時間10min、提取溫度50～60℃、提取時間4h。在此條件下制備的魚皮明膠凝膠強(qiáng)度與得率分別達(dá)到274g和75.04%。而采用常規(guī)法制備的魚皮明膠以上兩指標(biāo)分別為234g和66.13%[15]。由此可見，適宜的超高壓作用可以顯著提高魚皮明膠凝膠強(qiáng)度和得率，尤其是相對于傳統(tǒng)酸堿提取工藝，明膠的得率大大提升，幾乎達(dá)到100%。這是由于傳統(tǒng)工藝中魚皮明膠會在酸堿作用后的清洗過程中大量損失[16]，而采用超高壓代替酸堿處理，恰恰消除了這一損失。

2.3 明膠溶解溫度與凝膠溫度測定

圖5 魚皮明膠溶液在加熱過程(A)和冷卻過程(B)中的相角變化Fig.5 Evolution of phase angle during heating and cooling processes of fish gelatin solution

相角衡量明膠在不同相變的過程中體現(xiàn)的應(yīng)力和張力的變化，由圖5可知，在加熱過程中常規(guī)工藝制備的魚皮明膠在22.2℃時溶解，在冷卻過程中14.2℃時形成凝膠；而超高壓工藝制備的明膠溶溶解和凝膠形成點分別為23.6℃和16.4℃，兩項指標(biāo)均高于常規(guī)工藝。研究[17-18]表明，明膠的凝凍溫度和溶化溫度與其中亞氨基酸(脯氨酸與羥脯氨酸)含量及其平均相對分子質(zhì)量有關(guān)，明膠中亞基氨基酸含量越高，明膠的平均相對分子質(zhì)量越高，其凝凍溫度和溶化溫度越高。由表2可見，超高壓法和常規(guī)法制備的魚皮明膠亞基氨基酸含量基本相同，分別為18.63%和18.94%。由此可證明，超高壓工藝制備的明膠凝凍溫度和溶化溫度較高的原因在于其比常規(guī)法制備的明膠含有更多的高分子組分，這些組分可能是由于超高壓導(dǎo)致蛋白聚合的產(chǎn)物。

表2 巴沙魚皮明膠氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of gelatin from Basa fish skin

3 結(jié) 論

3.1 通過單因素試驗分析，得到超高壓法制備高凝膠強(qiáng)度魚皮明膠提取工藝參數(shù)為超高壓壓力300MPa、超高壓時間10min、提取溫度50～60℃、提取時間4h，在此條件下明膠凝膠強(qiáng)度可達(dá)274g，得率可達(dá)75.03%。

3.2 性質(zhì)研究表明，超高壓法制備的魚皮明膠溶解溫度和凝膠溫度分別為23.6℃和16.4℃，兩項指標(biāo)均高于常規(guī)法明膠，其原因可能在于超高壓明膠含有更多的高分子組分。

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Ultra-high Pressure-assisted Extraction of Gelatin from Fish Skin

ZHANG Yu-hao1,2，MA Liang1,2，SHI Xuan3
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China；3. Chongqing Research Institute of Biotechnology Co. Ltd., Chongqing 401121, China)

In order to establish a clean production process of fish gelatin, the ultra-high pressure-assisted extraction of gelatin from fish skin was investigated to explore the effects of ultra-high pressure treatment pressure, ultra-high pressure treatment time, extraction temperature and extraction time on gel strength and yield of gelatin. Results indicated that the optimal extraction processing conditions were ultra-high pressure treatment pressure of 300 MPa, ultra pressure treatment time of 10 min,extraction temperature of 50－60 ℃ and extraction time of 4 h. Under the optimal extraction conditions, the gel strength and the yield of gelatin were 274 g and 75.03%, respectively. The melting and gelling temperatures were 23.6 ℃ and 16.4 ℃, respectively.

ultra-high pressure；fish gelatin；gel strength；yield

TS254.9

A

1002-6630(2011)06-0099-05

2010-05-24

重慶市科技公關(guān)項目(2009AC5182)；西南大學(xué)博士基金項目(SWUB2007045)

張宇昊(1978—)，男，副教授，博士，主要從事蛋白與生物活性肽研究。E-mail：zhy1203@yahoo.com.cn