高效液相色譜法快速測定大米中的4種煙堿農(nóng)藥殘留量

乙小娟，朱加葉，丁 萍，夏擁軍

(張家港出入境檢驗檢疫局，江蘇 張家港 215600)

高效液相色譜法快速測定大米中的4種煙堿農(nóng)藥殘留量

乙小娟，朱加葉，丁 萍，夏擁軍

(張家港出入境檢驗檢疫局，江蘇 張家港 215600)

建立使用高通量(RRHT)色譜柱的高效液相色譜法同時測定大米中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清四種煙堿農(nóng)藥殘留量的方法。樣品用乙腈提取，采用ENVI-Florisil和Carb復(fù)合固相萃取柱萃取凈化，液相色譜高通量RRHT色譜柱，258nm紫外測定，外標(biāo)法定量。檢測過程快速準(zhǔn)確，2.5min時4種農(nóng)藥可完全分離。樣品中加標(biāo)回收率為75.5%～96.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49%～4.36%，最低檢出限達(dá)到0.004mg/kg。峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0.1～1.0mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)大于0.9996。

呋蟲胺；噻蟲胺；吡蟲啉；吡蟲清；液相色譜；高通量色譜柱；固相萃取；大米

煙堿類殺蟲劑的作用機制主要是通過選擇性控制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)煙堿型乙酰膽堿酯酶受體，阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致害蟲出現(xiàn)麻痹進(jìn)而死亡[1]?？捎行Х乐瓮崮?、鞘翅目、雙翅目和鱗翅目等害蟲，對用傳統(tǒng)殺蟲劑防治產(chǎn)生抗藥性的害蟲也有良好的活性。

從20世紀(jì)80年代中期由德國拜耳公司成功開發(fā)出第一個煙堿類殺蟲劑一吡蟲啉問世到目前為止，已有十幾個產(chǎn)品商品化或即將商品化[1]。如呋蟲胺(dinotefuran)、噻蟲胺(clothianidin)、吡蟲啉(imidacloprid)、啶蟲脒(acetamiprid，又名吡蟲清)等[2-4]，日本已規(guī)定大米中這4種煙堿類農(nóng)藥最高殘留限量(MRL)為0.01～2mg/kg[5]，澳大利亞對谷物中吡蟲啉的最高殘留限量是0.05mg/kg[6]。

目前有文獻(xiàn)報道用HPLC-MS/MS檢測食品中的呋蟲胺[7]。文獻(xiàn)[8-10]報道用高效液相色譜法測定(HPLC)測定茶葉、蔬菜、水果中吡蟲啉的殘留。文獻(xiàn)[11-15]檢測蔬菜、茶葉和水果中吡蟲啉或啶蟲脒，文獻(xiàn)[16]報道了茶葉中6種煙堿農(nóng)藥的HPLC-MS/MS檢測。目前尚未見使用高通量色譜柱的液相色譜方法同時檢測大米中4種煙堿類殺蟲劑殘留的報道。本實驗對大米中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的高效液相色譜測定方法進(jìn)行研究，考察不同質(zhì)量濃度的呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清在Florisil-Carb復(fù)合固相萃取柱上的保留行為。本方法采用乙腈提取，復(fù)合固相萃取柱凈化，HPLC-DAD分離檢測，外標(biāo)法定量，旨在建立采用快速分離高通量色譜柱(rapid resolution high throughput，RRHT)同時測定大米樣品中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清殘留量的液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

稻谷經(jīng)清理、碾米、成品整理后的成品大米。

呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥97%)；乙腈(色譜純)；正己烷(農(nóng)殘級)；丙酮(紫外光譜純)；氯化鈉(分析純)，140℃烘烤4h，置于干燥器內(nèi)備用。

HP1200高效液相色譜儀(附DAD檢測器) 美國安捷倫公司；R200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士公司；KQ-500D超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；SPE小柱處理系統(tǒng) 美國Supelco公司；Superclean ENVI-Florisil(500mg/3mL)和Superclean ENVI-Carb(500mg/3mL)固相萃取柱；T25勻漿機 德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的提取

稱取25g粉碎試樣，置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL水浸泡15min，準(zhǔn)確加入乙腈50mL，振蕩提取30min后過濾，濾液收集到裝有5～7g氯化鈉的100mL具塞量筒中，收集濾液60～80mL，蓋上塞子，劇烈振蕩，靜置，使乙腈相和水相分層，從100mL具塞量筒中吸取25.00mL乙腈溶液，放入125mL心型瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃以下濃縮至近干。用1mL丙酮溶解殘渣，待殘渣完全溶解后，加入9 m L正己烷，混勻，待凈化。

1.2.2 固相萃取凈化樣品

將Florisil和Carb固相萃取柱用連接頭上下串聯(lián)起來(Carb固相萃取柱在上)，5mL正己烷預(yù)淋洗，將1.2.1節(jié)制備的溶液移入Florisil和Carb的復(fù)合柱中，棄去流出液。然后用10mL丙酮-正己烷(50:50)淋洗柱子，收集15mL淋洗液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃以下濃縮至近干，用乙腈-水(30:70)定容至1mL，經(jīng)0.22μm濾器濾至樣品瓶內(nèi)，待測。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取適量的呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈-水(30:70)將儲備液稀釋成0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按選定色譜條件進(jìn)樣，以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的質(zhì)量濃度(X)和組分色譜峰面積(Y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，4種化合物在0.1～1.0mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equations and correlation coefficients of four neonicotinoid residues

1.3 色譜條件

色譜柱：XDB C18(4.6mm×50mm，1.8μm) RRHT；色譜柱溫度：25℃；流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.2%的甲酸溶液，B為乙腈。

梯度洗脫：流動相：0.2%甲酸溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序：0min時，5% B；0～1.5min，線性增加至35% B，保持到3.5min，再升至75%，4.5min結(jié)束，之后進(jìn)行系統(tǒng)平衡，平衡時間2min；流速2mL/min；進(jìn)樣量2μL；檢測波長258nm，采集時間0.01min。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取劑的選擇

煙堿類農(nóng)藥屬于極性物質(zhì)，易溶于甲醇、乙腈等[16]，本實驗以乙腈為提取劑對大米中的煙堿類農(nóng)藥進(jìn)行提取。結(jié)果表明，用乙腈提取樣品，不僅可以減少大米中油脂的提取量，而且煙堿類農(nóng)藥的回收率也能滿足要求。為了更好地保證乙腈滲入大米體內(nèi)，在大米中先加入適量的水浸潤大米樣品，使其細(xì)胞完全漲開，再加入乙腈振蕩，可提高提取效率。

2.2 固相萃取柱的選擇

Florisil屬于一種正相固相萃取柱，對極性較強的化合物吸附力較強，是從有機基體中去除或分離極性物質(zhì)的理想之選，它可以有效地吸附樣品中的脂肪酸和葉黃素[17]。選用Florisil柱凈化，用體積比1:9的丙酮-正己烷溶解提取液殘渣，采用體積比1:1的正己烷-丙酮洗脫，洗脫液中仍有黃色色素存在；然后通過使用Florisil和Carb混合凈化柱凈化，色素被活性炭吸附，減少了色素的干擾。當(dāng)收集洗脫液15mL時，通過實驗發(fā)現(xiàn)，洗脫液中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清4種煙堿農(nóng)藥的回收率可達(dá)95%以上。但是直接用10mL體積比為1:9的丙酮-正己烷溶解提取液殘渣，再用弗羅里硅土和活性炭混合凈化柱凈化，四種農(nóng)藥的回收率低，均小于60%；改用1mL丙酮溶解提取液殘渣，再加入9mL正己烷混勻凈化，回收率符合實驗要求。這可能是由于煙堿農(nóng)藥的極性大，體積比為1:9的丙酮-正己烷不能完全溶解樣品提取液殘渣中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的緣故。

2.3 液相色譜柱的選擇

快速分離高通量(RRHT)色譜柱是指柱內(nèi)填料粒徑為1.8μm、長度只有50mm的液相色譜柱，這種色譜柱在保證分離度的情況下，可以大大提高分析時間，縮短檢測周期[18]。采用XDB C18(4.6mm×50mm，1.8 μ m) RRHT柱在2.5min時就達(dá)到了4種煙堿農(nóng)藥的完全分離(圖1)，比使用常規(guī)(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱加快了十幾分鐘，大大提高了工作效率。

圖1 呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of four neonicotinoid standards

2.4 檢測波長的選擇

對于紫外-可見檢測器，檢測時一般選擇對樣品有最大吸收的波長進(jìn)行，以獲得最大的靈敏度和抗干擾能力，對4種標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了光譜掃描，呋蟲胺在270nm處有最大吸收，噻蟲胺在260nm處有最大的吸收，吡蟲啉在270nm處有最大的吸收，吡蟲清在250nm處有最大的吸收，綜合考慮4種農(nóng)藥同時檢測的靈敏度，實驗結(jié)果表明，當(dāng)檢測波長設(shè)定為258nm時，相同質(zhì)量濃度的呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清標(biāo)準(zhǔn)溶液能夠獲得相似的靈敏度，最終選擇258nm作為檢測波長。

2.5 流動相的優(yōu)化

在等度反相分離時，通過對標(biāo)準(zhǔn)溶液的實驗表明，當(dāng)乙腈-水體積比為35:65左右時，檢測的靈敏度達(dá)到最佳，但呋蟲胺峰型不是很好。當(dāng)使用0.2%甲酸為流動相A，起始梯度為95% A＋5% B時，峰型改善，1.5min后梯度上升至35% B，在所使用的梯度條件下，可將所有色譜峰在2.5min左右達(dá)到基線分離。整個分析4.5min結(jié)束。

2.6 溶劑效應(yīng)

使用純乙腈作定容溶劑時，由于樣品溶劑強度大于乙腈-水流動相，呋蟲胺的峰形有所拖尾(伸舌)，會引起譜峰展寬和變形而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)，而后面的3個峰不受影響，溶解樣品有機相比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于起始流動相中有機相比例時，色譜峰(尤其是較早洗脫的色譜峰)會有展寬現(xiàn)象。本實驗在乙腈中加入一定量的水調(diào)節(jié)溶劑強度，峰形窄而對稱，峰形得到明顯改善。將乙腈-水(30:70)作為樣品溶劑進(jìn)樣，進(jìn)樣量大時呋蟲胺的峰明顯拖尾，通過實驗將樣品量定為2μL。

2.7 回收率及精密度實驗

按RSN=10計算，本方法呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉和吡蟲清的最低檢出限均為0.004mg/kg。

采用添加回收的方法，在空白大米樣品中，分別稱取3份不含呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的大米樣品，分別添加10μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.025、0.05、0.10mL，每份樣品按樣品檢測方法重復(fù)檢測6次，測得呋蟲胺回收率在87.5%～94.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.57%～2.48%之間；噻蟲胺回收率在79.0%～90.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.49～3.80%之間；吡蟲啉回收率在75.5%～96.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.82%～3.91%之間；吡蟲清回收率在91.8%～94.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.01%～4.36%之間。結(jié)果見表2。0.01mg/kg加標(biāo)色譜圖見圖2。

表2 呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的回收率和精密度Table 2 Results of precision and recovery rate experiments

圖2 大米加標(biāo)圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of spiked rice sample

3 結(jié) 論

運用液相色譜高通量柱同時測定了大米中4種煙堿農(nóng)藥。所建立的方法簡便快速，2.5min內(nèi)在色譜上即可達(dá)到4種農(nóng)藥完全分離；準(zhǔn)確度和精密度高，加標(biāo)回收率在75.5%～96.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.49%～4.36%；方法靈敏度高，最低檢出限達(dá)到0.004mg/kg。完全可滿足進(jìn)出口大米中4種煙堿農(nóng)藥的檢測要求。

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Determination of Neonicotinoid Residues in Rice by HPLC

YI Xiao-juan，ZHU Jia-ye，DING Ping，XIA Yong-jun
(Zhangjiagang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhangjiagang 215600, China)

A reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method has been developed for determining dinotefuran, clothianidin, imidacloprid and acetamiprid residues in rice. Neonicotinoid residues were extracted from the sample by acetonitrile, and then cleaned up with ENVI-Florisil and carb SPE tube. The HPLC detection was performed using a DAD detector in the external standard mode. Results indicated that average recovery rates in spiked samples were in the range of 75.5%－96.0%, the relative standard deviations varied between 0.49% and 4.36% and the detection limit was 0.004 mg/kg. A good linear correlation between peak areas and the concentrations of four neonicotinoid residues was observed in the range of 0.1－1000μg/mL with a calibration coefficient of 0.9996.

dinotefuran；clothianidin；imidacloprid；acetamiprid；high performance liquid chromatography；solid phase extraction；rice

O657.7

A

1002-6630(2011)06-0169-04

2010-05-04

江蘇省出入境檢驗檢疫局科研項目(2006KJ14)

乙小娟(1967—)，女，副主任技師，本科，主要從事進(jìn)出口食品檢測研究。E-mail：yxj671001@yahoo.com.cn