超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中的三聚氰酸

牛之瑞，馮 雷，李 波，祝紅昆，珠 娜，潘 媛

(云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650223)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中的三聚氰酸

牛之瑞，馮 雷，李 波，祝紅昆，珠 娜，潘 媛

(云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650223)

建立奶粉中的三聚氰酸的超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。樣品經(jīng)透析袋凈化、反相液相色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下進(jìn)行特征母-子離子對(duì)信號(hào)采集。根據(jù)保留時(shí)間、母離子和兩個(gè)特征子離子信息進(jìn)行定性分析，以離子對(duì)m/z42.0進(jìn)行定量。三聚氰酸的最低檢測(cè)限(RSN=3)為100.0 μg/kg。在100.0～2000.0μg/L時(shí)峰強(qiáng)度與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好(r2≥0.9999)。在100.0、500.0、1000.0μg/kg 3個(gè)添加水平，三聚氰酸的回收率范圍為87.5%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9%。結(jié)果表明，該法簡(jiǎn)單、靈敏，適用于奶粉中三聚氰酸的分析確證。

三聚氰酸；奶粉；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

三聚氰酸(cyanuric acid，CA)又名氰脲酸，是氫氰酸(HOCN)的三聚體，分子式為C3H3N3O3，相對(duì)分子質(zhì)量為129.07。三聚氰酸與三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似，因含氮量高，有人作為偽蛋白添加到食品中使用，且研究證據(jù)顯示單獨(dú)攝入三聚氰胺毒性較低，同時(shí)攝入三聚氰酸和三聚氰胺后會(huì)導(dǎo)致腎結(jié)石，國(guó)外已有報(bào)道乳制品中檢出三聚氰酸[1]。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)三聚氰酸的方法多為氣質(zhì)聯(lián)用法[2]，需要進(jìn)行衍生化后才能夠上機(jī)檢測(cè)，操作比較復(fù)雜。液相色譜法多采用正相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)三聚氰酸[3]。國(guó)外已經(jīng)有一些關(guān)于三聚氰酸的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)法研究，但一般在預(yù)處理階段均采用固相萃取小柱的方法，取得了比較好的效果，但普遍存在成本偏高，操作繁瑣等缺點(diǎn)[4-15]。將奶粉溶解后經(jīng)透析紙透析，用反相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，取得了較好的檢測(cè)結(jié)果，找到了一個(gè)操作簡(jiǎn)便且成本相對(duì)低廉的三聚氰酸檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶粉 市售。

三聚氰酸標(biāo)樣 美國(guó)Sigma公司；乙腈(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；18.2M Ω超純水 德國(guó)賽多利斯公司；透析袋 上海Green Bird公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CPA225D電子天平 德國(guó)Sartorius公司；ACQUITY超高效液相色譜、ACQUITY UPLC HILLIC(2.1×100mm，1.7μm)色譜柱 美國(guó)Waters公司；API-3200串聯(lián)質(zhì)譜儀、Analyst質(zhì)譜工作站 加拿大AB公司。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜

流動(dòng)相A為10mmol/L甲酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量5μL；柱溫：3 0℃。

表1 三聚氰酸的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of cyanuric acid

1.3.2 串聯(lián)質(zhì)譜

UPLC-MS/MS接口為電噴霧接口(ESI)負(fù)離子模式，離子監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，噴霧電壓(IS)-4500V，噴霧氣(GS1)、輔助氣(GS2)、氣簾氣(CUR)、碰撞氣(CAD)均為高純氮?dú)?，噴霧氣氣壓為60psi，輔助氣氣壓為65psi，氣簾氣氣壓為20psi，碰撞氣氣壓為5psi，輔助噴霧氣溫度為600℃，去簇電壓(DP)為－32.0V，入口電壓(EP)為－8.0V，其他參考條件參見(jiàn)表2。

表2 三聚氰酸定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、采集時(shí)間、碰撞能量和碰撞室出口電壓Table 2 Qualitative ion pair, quantitative ion pair, harvest time,collision energy and collision cell exit voltage of cyanuric acid

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g于10mL容量瓶中，用乙腈-水(1:1)稀釋至刻度，得到1.0mg/mL儲(chǔ)備溶液，于－5℃避光保存。臨用前，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成所需濃度，添加到陰性樣品中，然后進(jìn)行樣品前處理。

1.5 樣品前處理

稱取2g樣品(精確到0.01g)于10mL離心管中，加入約60℃溫水，立即旋渦混勻，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至折疊好的透析袋中，用5mL水分兩次洗滌離心管，一并加入到透析袋中，將袋口扎緊，置于50mL燒杯中，加入10mL水透析，用保鮮膜將燒杯口密封，60℃水浴3h，然后室溫放置13h后精確吸取透析液5mL于10mL容量瓶中用乙腈定容，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

三聚氰酸溶于熱水，采用透析的方法，直接用水在60℃條件進(jìn)行提取，用保鮮膜將燒杯口封嚴(yán)，盡量減少水分蒸發(fā)帶來(lái)的誤差。如果采用透析液直接進(jìn)樣，色譜柱對(duì)水相十分敏感，出峰時(shí)間會(huì)發(fā)生漂移，無(wú)法達(dá)到檢測(cè)要求，所以，取5mL提取液用乙腈定容至10mL后進(jìn)樣?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以較好的減少因回收率問(wèn)題帶來(lái)的誤差。

2.2 MS/MS條件和解離機(jī)理

圖1 三聚氰酸一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Primary mass spectrum of cyanuric acid

圖2 三聚氰酸二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary mass spectrum of cyanuric acid

歐盟在EC/657指令中規(guī)定，利用質(zhì)譜方法對(duì)藥物殘留進(jìn)行確證，必須滿足4個(gè)識(shí)別點(diǎn)的要求，同時(shí)特征離子的豐度比要和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本一致。采用串聯(lián)質(zhì)譜，一個(gè)母離子(圖1)加兩個(gè)特征離子(1.5點(diǎn)×2)可滿足確證需要。三聚氰酸二級(jí)質(zhì)譜的特征離子對(duì)分別為m/z127.9/42.0、127.9/84.8(圖2)；加標(biāo)樣品中殘留物的特征離子豐度與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本一致，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量離子色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 三聚氰酸標(biāo)樣(5.0ng/mL)定量離子色譜圖Fig.3 Quantitative ion chromatograph of chloramphenicol standard(5.0 ng/mL)

2.3 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，稀釋倍數(shù)為20倍。三聚氰酸在100～2000 μ g/kg(經(jīng)樣品前處理后溶液中的質(zhì)量濃度為5.0～100.0μg/L)內(nèi)線性良好，線性方程為y=67.8x＋70.7，相關(guān)系數(shù)為0.9999；根據(jù)信噪比(RSN)=3計(jì)算，儀器檢出限為5.0μg/L，樣品檢出限為100μg/kg。

2.4 回收率和精密度

三聚氰酸樣品添加實(shí)驗(yàn)選擇100.0、500.0、1000.0 μg/kg，3個(gè)添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收，以離子對(duì)m/z127.9/42.0進(jìn)行定量。由表3可見(jiàn)，三聚氰酸的回收率范圍為87.5%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9%。

表3 方法精密度和回收率(n＝4)Table 3 Precision and recovery rate of this method (n＝4)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

圖4 加標(biāo)奶粉樣品定量離子色譜圖Fig.4 Quantitative ion chromatograph of spiked milk powder sample

按照本方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析，從圖4可以看出，樣品中的三聚氰酸很好地被分離，無(wú)干擾峰，且分析時(shí)間很短。

3 結(jié) 論

本方法采用透析的方法對(duì)奶粉樣品進(jìn)行處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)奶粉中的三聚氰酸。本方法具有分析速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)，適合大量樣品的快速分析要求。

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Determination of Cyanuric Acid in Milk Powder by UPLC-MS/MS

NIU Zhi-rui，F(xiàn)ENG Lei，LI Bo，ZHU Hong-kun，ZHU Na，PAN Yuan
(Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Kumming 650223, China)

An ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the determination of cyanuric acid residues in milk powder. Samples were thoroughly suspended in 60 ℃water and dialyzed against deionized water for 3 h in 60 ℃ water bath before analysis on reversed-phase high performance liquid chromatography-quadrupole tandem mass spectrometry. Mass spectral acquisition was applied with a multiple reactionmonitoring (MRM) mode. Qualitative analysis was achieved on the basis of the retention time and information about parent ions and two daughter ions. Quantitative determination was carried out on the basis of the characteristic ion ofm/z42.0. The linear range for cyanuric acid was between 5μg/L and100μg/L with a correlation coefficients (r2) of larger than 0.9999. The average recovery rate for cyanuric acid ranged between 87.5% and 98.8% in milk powder samples spiked at the levels of 100.0, 500.0 μg/kg and 1000.0μg/kg. The relative standard deviation (RSD) was less than 9%. The detection limit of this method was 100.0μg/kg.Therefore, this method is simple and suitable for routine analysis of milk powder.

cyanuric acid；milk powder；UPLC-MS/MS

TS207.3

A

1002-6630(2011)06-0173-03

2010-04-20

牛之瑞(1982—)，男，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)、獸藥殘留檢測(cè)。E-mail：bull.nzr@163.com