紡錘體組裝檢測(cè)點(diǎn)基因BubR1的研究進(jìn)展

陳曌君，李 鋒，楊 軍 綜述

(1.浙江大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理系，浙江 杭州 310058;2.山西省侯馬市人民醫(yī)院，山西 侯馬 043000)

上世紀(jì)90年代初期，研究人員在酵母基因篩查試驗(yàn)中找到一系列與紡錘體檢測(cè)點(diǎn)調(diào)控有關(guān)的基因，并證實(shí)這些基因在高等動(dòng)物中高度保守，其編碼的蛋白是紡錘體檢測(cè)點(diǎn)(spindle assembly checkpoint，SAC)的重要組成成分［1-2］。SAC成員主要包括Mad1(mitotic arrestdeficient 1)、Mad2，Bub1(budding uninhibited by benzimidazoles 1)、Bub3，BubR1(Bub-related 1)，Msp1(monopolar spindle 1)，Aurora B 等蛋白［3］。其中，BubR1是 SAC中的重要組分，在調(diào)控SAC的監(jiān)測(cè)機(jī)制中起著重要的作用。近來有研究表明，BubR1不但參與監(jiān)測(cè)有絲分裂過程中微管與著絲點(diǎn)的結(jié)合，還在細(xì)胞減數(shù)分裂過程、DNA損傷應(yīng)答、腫瘤、不孕和衰老［4-7］等方面起到重要的調(diào)控作用。現(xiàn)將紡錘體檢測(cè)點(diǎn)蛋白BubR1的功能及研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 BubR1在紡錘體檢測(cè)點(diǎn)中的作用

紡錘體檢測(cè)點(diǎn)又稱有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)，在監(jiān)測(cè)染色體的正常分離及阻止非整倍體形成的過程中起到重要的作用。在細(xì)胞有絲分裂中期，只有當(dāng)染色體全部正確地與來自紡錘體兩極的微管結(jié)合并排列到赤道板上，有絲分裂后期促進(jìn)因子(anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C)才能與其活化因子Cdc20結(jié)合，并通過泛素化其底物(如CyclinB1、Securin)使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂后期［8］。否則，SAC這一檢測(cè)通路將會(huì)被激活，從而阻止細(xì)胞由分裂中期進(jìn)入后期。

1.1 BubR1在有絲分裂SAC中的作用 在有絲分裂中，BubR1主要是感受姐妹染色單體上著絲點(diǎn)間的張力［9］以及著絲粒相關(guān)蛋白 E(centromere associated protein-E，CENP-E)共同監(jiān)測(cè)著絲點(diǎn)上微管的附著狀態(tài)［10］。一旦著絲點(diǎn)與微管未連接或著絲點(diǎn)間的張力不平衡將導(dǎo)致SAC監(jiān)測(cè)機(jī)制的激活［8］。SAC被激活后，BubR1借助其結(jié)構(gòu)上所具有的不依賴Mad2的Cdc20結(jié)合位點(diǎn)與Cdc20蛋白結(jié)合并抑制其活性［11-12］。另外，BubR1也可通過Mad2與Cdc20結(jié)合，形成Bub3-BubR1-Cdc20復(fù)合體從而抑制APC/C 的活性［13-14］;同時(shí)研究顯示，BubR1 先于Mad2與Cdc20結(jié)合，且對(duì)APC/C的抑制能力更強(qiáng)［15］。BubR1還可與Bub3、Mad2 和Cdc20形成有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)復(fù)合物(mitotic checkpoint complex，MCC)四聚體，抑制 APC/C的活性［16-17］，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂后期。只有當(dāng)所有的紡錘體微管與著絲點(diǎn)正確連接，產(chǎn)生適當(dāng)?shù)膹埩Γ琒AC監(jiān)測(cè)機(jī)制關(guān)閉，Cdc20被釋放，細(xì)胞才能進(jìn)入有絲分裂后期［4］。

BubR1基因的缺失將導(dǎo)致SAC的妥協(xié)反應(yīng)［18］。研究表明，BubR1基因缺失的細(xì)胞能夠逃逸微管解聚劑——諾考達(dá)唑(nocodazole)引起的有絲分裂阻滯而進(jìn)入分裂后期，造成細(xì)胞具有異常的染色體數(shù)目，即非整倍體。BubR1在SAC上的作用存在一定的劑量依賴效應(yīng)。Bohers等［19］人的實(shí)驗(yàn)表明:在有絲分裂過程中，細(xì)胞經(jīng)紡錘體干擾物——秋水仙堿(colchicine)處理后所引起細(xì)胞阻滯的比例與細(xì)胞中BubR1的表達(dá)水平呈正相關(guān);且BubR1減少將引起染色體的超前分離(premature chromatid separation，PCS)，當(dāng) BubR1 的水平低于50%時(shí)，非整倍體的數(shù)量明顯增加。因此，BubR1的作用與其數(shù)量有關(guān)，且影響著非整倍體的產(chǎn)生。

1.2 BubR1在減數(shù)分裂SAC中的作用 在減數(shù)分裂與有絲分裂過程中SAC的不同之處僅僅在于減數(shù)分裂I期染色體間所產(chǎn)生的張力是來自于同源染色體而非姐妹染色單體。當(dāng)同源染色體上的著絲點(diǎn)與微管沒有正確的連接或是在同源染色體間產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)膹埩?，就?huì)激活SAC，使細(xì)胞停滯于前中期。在減數(shù)分裂II期，染色體與微管的連接、SAC的激活等均與有絲分裂相一致［20］。Wei［4］等人研究表明:BubR1基因缺失的卵母細(xì)胞經(jīng)nocodazole處理后，能逃逸SAC依賴的細(xì)胞周期停滯;BubR1的過度表達(dá)會(huì)使細(xì)胞停滯在第一次減數(shù)分裂中期的時(shí)間延長(zhǎng);而BubR1表達(dá)不足則會(huì)加速細(xì)胞減數(shù)分裂的過程。這些結(jié)果揭示了BubR1是第一次減數(shù)分裂中期SAC所必需的，這可能是由于BubR1表達(dá)增加/不足引起紡錘體檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)增強(qiáng)/減弱，從而延長(zhǎng)/縮短了減數(shù)分裂的時(shí)間，符合“檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)增強(qiáng)”假說。

2 BubR1參與DNA損傷應(yīng)答調(diào)控

當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期后遇到DNA損傷，通過啟動(dòng)“自殺”或者激活SAC來延緩細(xì)胞有絲分裂的過程，給細(xì)胞足夠時(shí)間將錯(cuò)誤予以修復(fù)，從而來維持基因的完整性。在酵母、果蠅或是哺乳動(dòng)物細(xì)胞［21-23］中SAC都能通過停滯有絲分裂的過程來應(yīng)答DNA損傷，而BubR1作為SAC蛋白，在此過程中起著重要的作用。Hyunsook和Lee等［24-25］報(bào)道了經(jīng)阿霉素(一種抗腫瘤藥物)處理細(xì)胞產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)后，大量的 BubR1結(jié)合到著絲點(diǎn)上，其磷酸化的時(shí)間延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比有絲分裂過程延遲9 h，這可能是由于DSBs改變了染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而影響了著絲點(diǎn)-微管粘附的狀態(tài)，引發(fā)了BubR1對(duì)此產(chǎn)生的一系列應(yīng)答反應(yīng)。另外，在酵母［24］、BRCA2缺失細(xì)胞［25］等研究表明 DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)(DNA damage checkpoint，DDC)與 SAC在 DNA 損傷修復(fù)中起著協(xié)同作用，而BubR1可能是介導(dǎo)這兩條通路交叉應(yīng)答(cross-talk)上的重要因子。Dai［5］等人也證實(shí)了這一結(jié)論:經(jīng)阿霉素和紫外線誘導(dǎo)的BubR1+/-MEFs細(xì)胞DNA受損后，引起有絲分裂停滯，同時(shí)伴隨著γH2AX、p53、p21、PARP-1蛋白表達(dá)水平的降低。

3 BubR1的磷酸化

細(xì)胞內(nèi)BubR1蛋白的數(shù)量與其功能相關(guān)，且共價(jià)修飾尤其是磷酸化修飾在其功能的調(diào)控上也起著重要的作用。研究表明，BubR1作為Plk1激酶的底物，能被Plk1磷酸化，磷酸化后的BubR1對(duì)維持著絲點(diǎn)-微管連接的穩(wěn)定性起著重要的作用，但不是其與SAC或APC/C連接所必須的［26-28］。Elowe 等［26］人研究表明，削弱BubR1與Plk1之間的關(guān)聯(lián)，會(huì)使BubR1磷酸化缺失，最終導(dǎo)致著絲點(diǎn)-微管穩(wěn)定性的降低。而且，BubR1的S676位點(diǎn)磷酸化對(duì)著絲點(diǎn)張力敏感。當(dāng)染色體排列在赤道板上即姐妹染色體著絲粒上形成張力時(shí)，S676位點(diǎn)上的磷酸化消失;當(dāng)再次用紫杉醇短暫處理后，pS676又會(huì)快速地出現(xiàn)。另外，Wong等［29］在非洲蟾蜍卵提取物的研究中發(fā)現(xiàn)，BubR1作為Plk1的底物，磷酸化后產(chǎn)生的3F3/2磷酸化表位在SAC中有一定的作用。然而，Timothy［10］等在BubR1上找到4個(gè)有絲分裂特有的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)不能夠被Plk1和Aurora B激酶磷酸化，且BubR1基因S670位點(diǎn)和S1034位點(diǎn)上的磷酸化對(duì)著絲點(diǎn)與微管間連接的缺失高度敏感，而對(duì)著絲點(diǎn)上的張力不敏感［10］，與之前Elowe等人證實(shí)的pS676位點(diǎn)對(duì)著絲點(diǎn)張力敏感的結(jié)論剛好相反［26］。這可能是BubR1磷酸化的位置是由微管粘附的狀態(tài)和著絲點(diǎn)上的張力所決定的。另外，還有研究報(bào)道［15］BubR1的磷酸化和乙?；荁ubR1由APC/C復(fù)合物的抑制劑轉(zhuǎn)變?yōu)锳PC/C底物的過程。

4 BubR1在腫瘤形成、不孕、衰老中的作用

由于BubR1對(duì)染色體的分離有特殊檢測(cè)功能，近來越來越多有關(guān)腫瘤方面的研究聚焦在BubR1這個(gè)重要的因子上。許多研究［30-31］表明，BubR1基因的缺失或半缺失(haploinsufficiency)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，最終觸發(fā)腫瘤的形成，如肺癌、結(jié)直腸癌。Kakeji等［6］報(bào)道50.3%的胃癌患者BubR1蛋白表達(dá)水平明顯增加，而且BubR1蛋白表達(dá)水平與DNA非整倍體間存在顯著的關(guān)聯(lián)性;BubR1高表達(dá)的患者常伴有腫瘤的深度浸潤(rùn)，以及生存率的降低。這可能是由于BubR1的過度表達(dá)導(dǎo)致MCC的減少，從而致使SAC監(jiān)測(cè)能力下降，讓染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞逃避監(jiān)測(cè)后直接進(jìn)入有絲分裂后期，最終造成DNA非整倍體的產(chǎn)生。

在腫瘤治療中，常利用抗癌藥物誘導(dǎo)基因損傷，激活細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞分裂停滯或者誘導(dǎo)其凋亡。然而，有許多因素可造成腫瘤對(duì)化學(xué)藥物的治療效果不佳，其中檢測(cè)點(diǎn)成分(如BubR1)表達(dá)異常所致的檢測(cè)點(diǎn)功能失常就是重要的原因之一［32］。因此，BubR1在腫瘤治療中倍受關(guān)注。

此外，BubR1蛋白表達(dá)水平與機(jī)體的不孕、衰老等有著密切的關(guān)系［7］。研究表明［33］:BubR1－/－大鼠的胚胎不能正常發(fā)育;BubR1－/H大鼠(表達(dá)BubR1蛋白水平的量是野生型的4%)的胚胎雖然能夠發(fā)育至出生，但出生后只能存活數(shù)小時(shí)。Baker等［34］人觀察到BubR1H/H的大鼠出生時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，但出生2～3個(gè)月就會(huì)表現(xiàn)出一些異常癥狀，如:雙側(cè)白內(nèi)障、真皮和皮下脂肪減少、惡病質(zhì)、損傷修復(fù)能力下降、生命周期減短等衰老的癥狀。4個(gè)月大的BubR1H/H大鼠的精子量是野生型大鼠的1/4;體外受精實(shí)驗(yàn)(BubR1H/H大鼠的精子和野生型大鼠的卵子結(jié)合)表明受精后的卵子發(fā)育為正常胚胎的數(shù)量明顯減少，僅為正常大鼠受孕后胚胎數(shù)的1/13。

5 展望

目前，雖然BubR1的功能及其作用機(jī)制已較為明確，但大部分僅限于體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，特別是在腫瘤的形成和治療上，仍有許多細(xì)節(jié)亟待解決。因此，對(duì)BubR1基因結(jié)構(gòu)、功能以及它與其他相關(guān)因子間相互作用等的深入研究，勢(shì)必有益于進(jìn)一步闡明BubR1與腫瘤、不孕、衰老等相關(guān)疾病的聯(lián)系，從而為解決這些困擾人類已久的問題提供新的思路。

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