虢 杰，楊仁黨，*，李雪云

（1.華南理工大學(xué)制漿造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；2.廣東省造紙技術(shù)與裝備公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640）

葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌紙及抗菌性研究

虢 杰1，2，楊仁黨1，2，*，李雪云1，2

（1.華南理工大學(xué)制漿造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；2.廣東省造紙技術(shù)與裝備公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640）

葡萄糖氧化酶是氧化葡萄糖的專一催化酶，具有脫氧、殺菌的功能。通過(guò)定性和定量抗菌實(shí)驗(yàn)方法研究了葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系在以淀粉作為載體和不混合淀粉時(shí)施涂于紙張表面的抗菌效果。定性抗菌實(shí)驗(yàn)表明，葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌紙具有良好的抗菌效果。而定量檢測(cè)結(jié)果表明，pH等于5.5時(shí)，35℃反應(yīng)10min，不添加淀粉時(shí)，葡萄糖氧化酶最小的抑菌濃度約為70U/m2，葡萄糖足量時(shí)，酶用量越高，抗菌率越好；添加0.7g/m2淀粉后，最小抑菌濃度提高到約650U/m2。淀粉對(duì)葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系的抗菌效果有較大影響，主要原因是淀粉能夠促進(jìn)細(xì)菌的繁殖。

葡萄糖/葡萄糖氧化酶，抗菌紙，抗菌性，定性與定量抗菌實(shí)驗(yàn)

抗菌紙是各種具有抑制危害紙品微生物能力的功能性紙張的統(tǒng)稱［1］，其抗菌效果來(lái)源于抗菌劑。一般來(lái)講，抗菌劑在低濃度時(shí)只有抑菌作用，而濃度增大或作用時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，可起到殺菌作用［2］。抗菌紙用于食品包裝時(shí)，可以使被包裝的食品、果蔬等延長(zhǎng)保質(zhì)期而不變質(zhì)。也就是說(shuō)，食品用抗菌包裝紙基本功能是：防止微生物的污染和昆蟲(chóng)的侵入，保護(hù)商品在生產(chǎn)和銷售過(guò)程中不變質(zhì)［3-4］。目前，超市里的生鮮食品，為了保持新鮮，延遲變質(zhì)時(shí)間，通常添加一些化學(xué)物質(zhì)或采用特殊的包裝技術(shù)來(lái)延長(zhǎng)貨架期，如添加二氧化氯做為保鮮劑，采用真空預(yù)處理和氣調(diào)包裝技術(shù)都能達(dá)到較好的延長(zhǎng)貨架期的目的［5-9］。但這些常規(guī)方法也存在不足的地方，有些生產(chǎn)成本較高，有些保鮮效果一般，貨架存放時(shí)間較短，影響產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)性。葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能專一地將β-D-葡萄糖（Glucose）氧化成為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，在食品保鮮、醫(yī)藥檢測(cè)等許多方面得到廣泛的應(yīng)用［10-12］，其化學(xué)反應(yīng)機(jī)理如下：

此外，Mattila Tiina和M.Sandholm［13］的研究結(jié)果顯示，葡萄糖/葡萄糖氧化酶的組合具有明顯的細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用。盡管在生鮮產(chǎn)品如牛肉、雞等表面噴灑葡萄糖氧化酶能起到抑菌、抗菌效果，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架時(shí)間，但工藝要求嚴(yán)格，質(zhì)量難以保證。本文將葡萄糖/葡萄糖氧化酶施涂于紙張表面，并探討其抗菌性，為開(kāi)發(fā)生鮮產(chǎn)品抗菌保鮮包裝紙?zhí)峁┘夹g(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

β-D-葡萄糖（Glucose） 分析純；葡萄糖氧化酶（GOD） 活性245U/mg，sigma公司產(chǎn)品，購(gòu)自廣州杰順生物科技有限公司；玉米原淀粉 水分90%；實(shí)驗(yàn)菌 大腸桿菌（Enterobacter cloacae）；培養(yǎng)基0.5%氯化鈉，0.5%牛肉膏，1.5%蛋白胨，1%瓊脂粉加去離子水配制而成；肉湯培養(yǎng)基 將所有成分溶于去離子水中，定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4，121℃下高壓滅菌20min取出，置于無(wú)菌室保存待用；瓊脂肉湯培養(yǎng)基 步驟同上，在無(wú)菌室中操作，將滅完菌后的瓊脂肉湯培養(yǎng)基溶液倒入滅菌平皿制成平皿培養(yǎng)基，培養(yǎng)基冷卻凝固后翻轉(zhuǎn)放置，1d后觀察是否有雜菌，如果沒(méi)有則可放于無(wú)菌室待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌紙制備 將去離子水配好的Glucose溶液、GOD溶液和糊化淀粉溶液在pH5.5和35℃恒溫下反應(yīng)預(yù)定時(shí)間后，全部施涂于直徑9cm的過(guò)濾紙表面上，用刮棒刮平，使液體均勻吸收且不流出來(lái)，放入干凈托盤(pán)中，在30℃真空干燥箱干燥一夜。

1.2.2 菌液制備 采用美國(guó)AATCC 100兩步法［14］在37℃下活化菌種，制取所需濃度的菌液。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)與檢測(cè)

1.2.3.1 抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)法定性檢測(cè)［15-16］用接種環(huán)將大腸桿菌菌液接種到制備好的培養(yǎng)基上并涂勻，覆蓋上事先剪好的圓形紙片，將培養(yǎng)皿倒置在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19h取出，根據(jù)抑菌環(huán)的大小來(lái)測(cè)定抗菌性能。

1.2.3.2 吸收法定量檢測(cè)［14，16］將抗菌紙和對(duì)照樣紙片放入三角燒瓶中后吸收定量的菌液，37℃下恒溫培養(yǎng)20±2h，或者不培養(yǎng)固定時(shí)間直接用肉湯培養(yǎng)基溶液把紙片上的細(xì)菌洗滌下來(lái)，稀釋適當(dāng)濃度后接種到平皿培養(yǎng)基上，然后倒置在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19h取出，進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算公式為：

細(xì)菌減少百分率（抗菌率）（%）=（“0”接觸時(shí)間試樣上細(xì)菌數(shù)-定期培養(yǎng)試樣上細(xì)菌數(shù)）/“0”接觸時(shí)間試樣上細(xì)菌數(shù)×100%

或細(xì)菌減少百分率（%）=（“0”接觸時(shí)間對(duì)照樣上細(xì)菌數(shù)-定期培養(yǎng)試樣上細(xì)菌數(shù)）/“0”接觸時(shí)間對(duì)照樣上細(xì)菌數(shù)×100%

或細(xì)菌減少百分率（%）=［（“0”接觸時(shí)間試樣上細(xì)菌數(shù)+“0”接觸時(shí)間對(duì)照樣上細(xì)菌數(shù)）/2-定期培養(yǎng)試樣上細(xì)菌數(shù)］/［（“0”接觸時(shí)間試樣上細(xì)菌數(shù)+“0”接觸時(shí)間對(duì)照樣上細(xì)菌數(shù)）/2?×100%

如果“0”接觸時(shí)間試樣上的細(xì)菌數(shù)和“0”接觸時(shí)間對(duì)照樣上的細(xì)菌數(shù)差別較大時(shí)，取較大值；如果兩者差別不大時(shí)，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌環(huán)法定性抗菌效果

取葡萄糖用量3500、21000μmol/m2絕干紙，葡萄糖氧化酶用量3500、7000、21000U/m2（如表1中實(shí)驗(yàn)號(hào)1～6所示），pH 5.5，35℃下反應(yīng)10min后施涂于濾紙上，用抑菌環(huán)法定性檢測(cè)抗菌效果。

表1 不同比例葡萄糖/GOD/淀粉組合的抗菌效果

從表1看出，濾紙面積3.14cm2，1、3、5號(hào)抑菌環(huán)面積分別為7.61、4.90、2.17cm2，抗菌、抑菌效果很明顯，其葡萄糖用量為3.78g/m2，葡萄糖氧化酶用量分別為21000、7000、3500U/m2。因?yàn)槠咸烟茄趸缸鳛榇呋瘎?，其用量決定催化能力，從而影響生成產(chǎn)物量和抗菌效果；而葡萄糖用量0.63g/m2時(shí)，無(wú)論葡萄糖氧化酶用量是3500U/m2或是21000U/m2，都沒(méi)有明顯的抑菌環(huán)出現(xiàn)。

同樣取葡萄糖用量21000μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量如表1中實(shí)驗(yàn)號(hào)7～9所示，淀粉用量0.7g/m2。與1、3、5號(hào)對(duì)比，相同的葡萄糖和葡萄糖氧化酶用量時(shí)，7、8、9號(hào)的抑菌環(huán)面積都相對(duì)較小，抗菌效果不如未添加淀粉的明顯，加入淀粉載體后大大降低了抗菌效果。

2.2 葡萄糖/葡萄糖氧化酶的抗菌性定量分析

為了對(duì)葡萄糖/葡萄糖氧化酶的抗菌效果進(jìn)行更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析，采用定量吸收法檢測(cè)。首先優(yōu)化葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反應(yīng)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)中取葡萄糖用量350μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量350U/m2，反應(yīng)時(shí)間和抗菌率見(jiàn)表2。催化反應(yīng)1min，抗菌紙的抗菌率為3.4%，反應(yīng)5min為23.2%，比反應(yīng)1min的效果有很大提高，這說(shuō)明1min的反應(yīng)很不完全；反應(yīng)10min時(shí)抗菌率也比反應(yīng)5min的效果有明顯提高。對(duì)于以下實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間選擇10min。

表2 不同GOD/葡萄糖催化反應(yīng)時(shí)間的抗菌率

2.2.1 葡萄糖與抗菌率的關(guān)系 圖1表示葡萄糖氧化酶用量350U/m2時(shí)，葡萄糖用量與抗菌率的關(guān)系。抗菌率隨著葡萄糖用量的增加而提高，葡萄糖用量低于150μmol/m2，對(duì)細(xì)菌沒(méi)有抗菌效果，葡萄糖用量840μmol/m2，抗菌率達(dá)到80%。葡萄糖是反應(yīng)物，其用量直接影響生成物的量。繼續(xù)增加葡萄糖用量，抗菌率沒(méi)有明顯提高。由于酶用量的限制，即使繼續(xù)增加葡萄糖用量，抗菌率也基本保持不變。一定的酶濃度時(shí)，葡萄糖濃度在一定范圍內(nèi)，對(duì)抗菌率有很大的影響。

圖1 葡萄糖用量對(duì)抗菌效果的影響

2.2.2 葡萄糖氧化酶與抗菌率的關(guān)系 用固定的過(guò)量葡萄糖，檢測(cè)葡萄糖氧化酶對(duì)抗菌效果的影響（圖2）。葡萄糖用量2800μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量很低時(shí)，抗菌率隨著葡萄糖氧化酶用量的增加快速上升。當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度大于70U/m2時(shí)，檢測(cè)結(jié)果顯示大腸桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，在抗菌紙上培養(yǎng)20h后，大腸桿菌的數(shù)目比未培養(yǎng)20h的對(duì)照樣上的細(xì)菌數(shù)目減少，此時(shí)的酶濃度可以認(rèn)為是最小抑菌濃度（MIC）。當(dāng)酶用量達(dá)到350U/m2，抗菌率達(dá)到84%，酶用量550U/m2時(shí)，抗菌率91%，之后抗菌率雖然隨著酶用量的增加繼續(xù)提高，但增速與前面的相比明顯減慢。

圖2 葡萄糖氧化酶用量對(duì)抗菌效果的影響

2.2.3 淀粉對(duì)抗菌效果的影響 淀粉是目前常用的表面施膠劑，可以利用淀粉作為載體把葡萄糖/葡萄糖氧化酶施涂到紙基表面。實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖用量與葡萄糖氧化酶用量比為2∶1，溶液在相同的溫度和pH條件下反應(yīng)10min后，與糊化淀粉溶液混合均勻施涂到濾紙表面，抗菌率如圖3所示。

葡萄糖氧化酶用量700U/m2時(shí)，未添加淀粉的抗菌紙抗菌率為95%，添加0.7g/m2淀粉后抗菌紙的抗菌率只有2%，淀粉施膠劑對(duì)葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系的抗菌性能有很大影響。最小抑菌濃度也有明顯變化，未添加淀粉時(shí)為70U/m2，添加0.7g/m2淀粉時(shí)提高到650U/m2。從曲線可以看出，用淀粉作為載體，繼續(xù)增加葡萄糖和葡萄糖氧化酶用量可以提高抗菌效果。但是，由于淀粉是細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物，會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的生產(chǎn)，從而會(huì)影響抗菌紙的抗菌效果，這與抑菌環(huán)定性分析結(jié)果相符。

圖3 淀粉用量對(duì)抗菌效果的影響

3 結(jié)論

定性和定量抗菌實(shí)驗(yàn)表明，葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌紙具有良好的抗菌性能。當(dāng)pH為5.5，35℃下催化反應(yīng)10min時(shí)，反應(yīng)較充分，抗菌效果與葡萄糖、葡萄糖氧化酶和淀粉施載體用量有關(guān)。

葡萄糖氧化酶濃度一定時(shí)，葡萄糖濃度在一定范圍內(nèi)，對(duì)抗菌率有很大的影響，超過(guò)此范圍，抗菌率基本保持不變。葡萄糖用量充分時(shí)，抗菌率隨著葡萄糖氧化酶用量的增加而提高，酶用量550U/m2時(shí)，無(wú)淀粉施涂的抗菌紙抗菌率可超過(guò)90%。

不添加淀粉時(shí)，葡萄糖氧化酶最小抑菌濃度約為70U/m2；用0.7g/m2淀粉施膠后，最小抑菌濃度提高到約650U/m2，淀粉對(duì)葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系的抗菌效果有較大的影響。添加淀粉后，葡萄糖/葡萄糖氧化酶體系的抗菌效果變差，主要原因是淀粉促進(jìn)了細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此今后可以選用其它的不會(huì)促進(jìn)細(xì)菌繁殖的合成化合物如聚乙烯醇作為載體等進(jìn)行研究。

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Study on glucose/glucose oxidase antibacterial paper and its antimicrobial property

GUO Jie1，2，YANG Ren-dang1，2，*，LI Xue-yun1，2
（1.State Key Laboratory of Pulpamp;Papermaking Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Guangdong Public Laboratory of Process Technology and Equipment Team，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Glucose oxidase is specific for β-D-glucose，and of oxygen removal and antibacterial functions. Antimicrobial effects of paper coated via glucose/glucose oxidase with/without starch were investigated by means of qualitative and quantitative assay.Qualitative assay phenomenon showed that glucose/enzyme paper was capable of inhibiting bacteria growth to betterextent.The experimentalresults from quantitative assay demonstrated that minimal inhibition concentration（MlC）was about 70U per square meter under the conditions of pH 5.5，35 centigrade，10 minutes reaction time，and without starch.And that if the dosage level of enzyme rises with saturation of glucose，the germproof effects could be more remarkable.However，MlC was up to round 650U per square meter with 0.7 gram per square meter starch addition.The starch hereby imposed a significant negative effect on the antibacterial properties of glucose/enzyme paper.This owes to starch nutriment contributing to bacteria growth.

glucose/glucose oxidase；antibacterial paper；antimicrobial property；qualitative and quantitative assay

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0124-04

2009-12-25 *通訊聯(lián)系人

虢杰（1985-），男，碩士研究生，主要從事造紙技術(shù)與特種紙方面的研究。