馬泉芳,魏 然,劉春林

(湖南農業(yè)大學農學院,長沙 410128)

β-羅勒烯 (β-ocimene)是近年來發(fā)現(xiàn)的 ,與植物防御相關的植物通訊 (plant-communication)信號分子[1],在自然界中包括兩個同分異構體:順式-β-羅勒烯 (cis-β-ocimene) 和 反 式-β-羅 勒 烯 (trans-βocimene)。 β-羅勒烯是一種單萜 (monoterpenes)化合物。單萜是 C10類萜類化合物,由兩個異戊二烯結構單元組成,以鏈狀、環(huán)狀及其衍生物的形式廣泛存在于植物揮發(fā)油和樹脂中[2,3]。這類產物在植物的種群競爭、吸引昆蟲傳粉、植食性昆蟲防御等方面發(fā)揮著重要作用[4～6]。

研究發(fā)現(xiàn),植物在受到外界的脅迫后,植株能釋放出VOCs(volatile organic compounds),VOCs中含有一系列小分子的萜類化合物[7,8]。現(xiàn)在已經(jīng)了解到許多植物種類如:玉米、棉花、利瑪豆、馬鈴薯、煙草、擬南芥、番茄、地中海松、三葉草、月桃葉、黃瓜等等被節(jié)肢食草動物取食后,其葉片釋放的有機揮發(fā)物中都包含反式 -β -羅勒烯[7～10]。 已有研究結果表明 ,反式 -β-羅勒烯能激發(fā)與受害植株相鄰的植株產生誘導性防御反應并改變相鄰植物體內的代謝途徑,對病原微生物產生抗性或對食草動物產生驅趕作用[11～16]。劉春林等[17]以擬南芥為材料,分別選擇水楊酸信號傳導途徑啟動的指示基因 PR1與茉莉酸信號傳導途徑的指示基因PDF1.2基因片段為探針,運用 Northern雜交的方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β-羅勒烯能誘導完整植物中與水楊酸和茉莉酸有關防御基因的表達,而且發(fā)現(xiàn)β-羅勒烯能解除水楊酸和茉莉酸的拮抗作用。這表明β-羅勒烯是一種與植物防御啟動密切相關的信號分子。

β-羅勒烯這種單萜揮發(fā)性有機物是由萜類合成酶(terpeniod synthase,T PS)催化合成的。萜類合酶類,以氨基酸序列相似度 40%為基準將其分為 TPS-a～T PS-g 7個亞家族[18,19],它主要包括單萜合成酶(monoterpene synthase)、倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase)和二萜合成酶 (diterpene synthase)。除直鏈的多聚萜類 (如橡膠)外,大多數(shù)萜類化合物都具有環(huán)狀結構。單萜合酶分布于 TPS-b,T PS-d,TPS-f和 TPS-g 4個亞家族。單萜合酶基因表達受生物鐘調節(jié),表達量隨晝夜周期交替變換而出現(xiàn)高低變化。如金魚草月桂烯合酶、羅勒烯合酶,擬南芥月桂烯合酶、羅勒烯合酶基因的表達量和產物都呈現(xiàn)午后高、夜間低的晝夜交替規(guī)律[20,21]。

Aubourg等(2002)通過對擬南芥基因的序列分析發(fā)現(xiàn)擬南芥含有40個 TPS類似基因,并將這 40個相似基因組成的家族命名為 At TPS家族。At TPS03(Arabidopsis thaliana terpenoid synthase 03)基因是At TPS基因家族中的一員。 Jenny等人[22]通過cDNA克隆,鑒定了一個基因 At TPS03,它能編碼單萜合酶,這種單萜合酶能高特異性催化香葉基二磷酸生成β-羅勒烯。

為了研究β-羅勒烯的功能,需要獲得 At TPS03基因沉默的純合突變體。純合體的獲得將為進一步研究At TPS03基因在植物防御、植物通訊方面的作用奠定良好的基礎。本實驗所用材料是從美國擬南芥生物資源中心訂購 AtT PS03基因的 T-DNA插入突變體材料 CS879103,通過 PCR檢測對其基因型進行鑒定,獲得了8株穩(wěn)定的純合突變體株系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

At TPS03基因 T-DNA插入突變體 CS8791039(T4代)種子購自美國俄亥俄州立大學 ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center),野生型擬南芥(Col-0生態(tài)型)種子由本實驗室保存。

1.1.2 生物學試劑

2×Taq MasterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司,100 bp plus Marker購自北京全式金生物技術有限公司,Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自 Fermentas公司,引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)

先將種子消毒,然后散播于盛有蛭石的小缽內,置于4℃恒溫黑暗培養(yǎng)室內春化48h;春化后轉入人工生長室中培養(yǎng),環(huán)境條件為:恒溫22～24℃,光照強度為120～150μ mol/m2· s(1μ mol/m2· s=53.8 Lux),16 h光照 /8 h黑暗,相對濕度 75%,定時澆營養(yǎng)液。待其生長至 25 d左右時,取幼嫩葉用于 DNA分離。

1.2.2 單株植物總DNA提取

取擬南芥幼葉 2～3片于 1.5 mL離心管中,研棒研碎,至 65℃水浴鍋中水浴 15 min,加 2×CTAB DNA提取液 600μL和等體積氯仿∶異戊醇(24∶1),在渦漩器上混勻,14 000 rpm離心 7 min;取上清液至一新的 1.5 mL離心管中,加2倍體積無水乙醇,同時加上清液 1/10體積的 3 mol/L NaAC輕輕顛倒混勻(-20℃放置 20 min),14 000 rpm離心 10 min,吹干,溶于滅菌的超純水中后作為 PCR擴增的DNA模板。

1.2.3 DN A的 PCR擴增

PCR反應體系。反應體系為15μL:模板2μL,2×Taq MasterMix 7.5μL,正向引物 F 0.1μ L,反向引物R 0.1μL,用 ddH2O補足至 15μL。

PCR反應條件。 (1)預變性,94℃,3 min;(2)變性 ,94℃ ,40 s;(3)退火 ,62℃ ,35 s,72℃延伸 45 s(從變性至延伸 35個循環(huán));(4)最后延伸,72℃,7 min。反應結束 16℃保存。

1.2.4 PCR產物的檢測

檢測 PCR產物一般利用 1.6%的瓊脂糖凝膠進行電泳,其中電泳緩沖液為 1× T AE,電壓為 5 V/cm,用EB進行染色,PCR產物上樣量為 8μL,電泳結果用本實驗室的凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.5 PCR引物的設計

每個T-DNA單株基因型的鑒定需要3條引物,分別是:LP,位于基因組上距離 T-DNA插入位點左斷臂600 bp;RP,位于距離 T-DNA插入位點右臂端 300 bp;T-DNA左斷臂引物 LB3(表1)。 PCR引物設計參照(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2html.)相關資料。

1.2.6 純合突變體中模板基因表達的 RT-PCR驗證

待純合突變體生長至 32 d時,取 2株已被初步鑒定為純合子的植株和 1株野生型(Col-0),用剪刀在其蓮座葉上剪一刀,其中對每株純合子剪創(chuàng)2片,8 h后取樣,液氮速凍后,用 Trizol法提取RNA,用Fermentas公司的 Revert AidTM First Strand cDN A Synthesis Kit進行反轉錄得到 cDNA,然后對這 3株材料的At TPS03進行半定量RT-PCR分析,其中所用引物見表1。 PCR反應條件為 94℃預變 3 min,94℃50 s,61℃退火 40 s,72℃延伸 50 s,最后延伸 72℃ 8 min,16℃保存,擴增 35個循環(huán)。以基因 Actin2為對照。

表1 PCR擴增所用的引物及其序列Table 1 Primer sequences used for the PCRamplification

2 結果與分析

2.1 PCR引物設計

原理如圖1所示。當用 LP和 RP這對引物進行PCR檢測時,在野生型植株(wild type,WT)和雜合子(heterozygous lines,HZ)植株中產生一條 PCR產物帶,分子量大約是 900 bp,而純合子 (homozygous lines,HM)植株中沒有 PCR產物形成;當用 RP和 LB3這對引物 PCR檢測時,在野生型植株中沒有 PCR產物,而在雜合子植株和純合子植株中均有一條 PCR產物帶,分子量大小為 410+Nbp。

圖1 PCR引物設計原理a.PCR引物設計示意圖;b.電泳結果示意圖。來自http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2htmlFig.1 Principles of primer design of PCRa.Schematic diagram of primer design of PCR;B.Schematic diagram of Electrophoresis results

2.2 T-DNA插入位點鑒定結果

T-DNA突變體材料長至 25 d時,取 4株,提取基因組 DNA作為模板進行 PCR擴增,以一株野生型植株基因組 DNA作為對照模板。當分別用 LP、RP和RP、LB3這兩對引物進行 PCR擴增時,根據(jù)電泳結果(圖2)可判斷,除了作為對照的 1號泳道,其他相鄰的兩個泳道中,當有兩條分子量分別為 900 bp和 410+Nbp的 PCR產物時,說明該植株在該位點有 T-DNA插入,而且是雜合子植株(如 2和 3,6和 7號泳道 );當只有一條分子量為410+Nbp的 PCR產物時,說明該植株在該位點有 T-DNA插入,而且是純合子植株(如4和5,8和9號泳道)。通過PCR擴增和電泳結果分析,最后得到2株純合子植株,分單株收集種子。

待 T-DNA插入純合突變體材料長至 30 d時(圖3),其株型比 Col-0野生型小,抽薹早于 Col型。

2.3 純合子RT-PCR檢測

圖2 電泳結果Fig.2 Electrophoresis results

將已初步鑒定的 2株純合突變體與 1株野生型Col-0(圖3),用剪刀對蓮座葉進行剪創(chuàng)傷處理,8 h后,分別提取總 RNA,對分離的RNA進行 RT-PCR檢測,結果(圖4)顯示 2株純合突變體沒有擴增產物,而野生型 Col-0有帶,說明 AtTPS03基因的表達因 T-DNA插入而被完全沉默了。 T-DNA插入位點的鑒定結果與 RT-PCR兩方面的結果證實鑒定的 T-DNA插入純合突變體可以用于下一步的 AtT PS03基因對植物生長發(fā)育方面的研究。

圖3 a:Col-0野生型;b:T-DNA插入的純合子:2號 (為泳道中的 4和 5)和 3號(為泳道中的 8和 9)Fig.3 a:Columbia-0type;b:T-DNA insertion homozygous mutants:2(lane4,5)and3(lane8,9)

圖4 T-DNA插入純合子體內AtTPS03基因的表達情況Fig.4 AtTPS03gene expression of T-DNA insertion homozygous mutants

待 T-DNA插入純合突變體材料長至50 d時(圖5),與 Col-0型相比,T-DNA插入純合子其株型變小,葉片有的輕微泛黃,果莢變短,莖稈變細,成熟期早于 Col-0型。

3 討 論

圖5 a:Col-0野生型;b:T-DNA插入的純合子:2號和 3號Fig.5 a:Columbia-0type;b:T-DNA insertion homozygous mutants 2and 3

對 T-DNA插入突變體的鑒定,引物的設計一般是直接利用http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2html網(wǎng)頁提供的軟件。本實驗也是根據(jù)T AIR官方網(wǎng)站公布的基因 AT 4G16740.1的 T-DNA插入位置,找到其突變體的類型,搜索到檢測所需的3條引物,對突變體進行檢測,檢測結果小于 1 000 bp,與理論值1 044 bp有些出入,比網(wǎng)站上公布的結果小。

雙引物法檢測獲得的 T-DNA插入純合突變體,一定要對其進行基因表達分析。因為從理論上講,TDNA插入的片段比較大,插入突變往往使基因處于沉默狀態(tài),大多數(shù)實驗結果也證實這一理論。但是有時也會遇到,盡管是純合插入突變體,但是目標基因還是能夠表達。筆者實驗時就遇到過一次:得到的純合 TDNA插入突變體,插入位點是在基因的信號肽序列上,RT-PCR檢測結果卻發(fā)現(xiàn)該基因能夠轉錄獲得有功能的 cDNA。

在相同培養(yǎng)條件下,發(fā)現(xiàn) AtTPS03基因純合突變體與野生型Col-0的形態(tài)有差異。突變體株型變小,蓮座葉葉片泛黃,出現(xiàn)提前衰老現(xiàn)象;側枝數(shù)目少,莖稈變細,花型變小,果莢變短;成熟期早于 Col-0型。這種現(xiàn)象表明,AtT PS03基因可能參與調控植物的生長發(fā)育。所以本實驗獲得的 AtTPS03基因純合突變體為進一步研究β-羅勒烯的功能奠定了良好基礎。

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