崔永鋒，楊 貞，朱寶華，肖魯偉，童培建

1杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院骨科，杭州 3112002浙江中醫(yī)藥大學(xué) 骨傷科研究所，杭州 310053

·論著·

三氯醋酸-丙酮沉淀法用于骨組織蛋白的提取

崔永鋒1，楊 貞2，朱寶華1，肖魯偉2，童培建2

1杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院骨科，杭州 311200
2浙江中醫(yī)藥大學(xué) 骨傷科研究所，杭州 310053

目的探討三氯醋酸-丙酮沉淀法提取骨組織蛋白的可行性和效率。方法采用鹽酸脫鈣法和三氯醋酸-丙酮沉淀法，分別用于骨組織蛋白的提取，并對(duì)兩種方法的提取效率進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果三氯醋酸-丙酮沉淀法可獲得較高的骨蛋白提取率，與鹽酸脫鈣法相比，分子條帶分布范圍相近，且不受骨髓造血組織影響。結(jié)論三氯醋酸-丙酮沉淀法可以用于骨組織蛋白質(zhì)組的研究。

三氯醋酸-丙酮沉淀法；骨組織；蛋白提取

骨組織中含有大量蛋白質(zhì)分子，包括各種細(xì)胞因子，是細(xì)胞增殖、分化、基質(zhì)合成和調(diào)控的重要信息物質(zhì)，在各種骨骼疾病中發(fā)揮決定性的作用。由于骨組織的特殊性，直接從骨組織中提取蛋白有較大難度，這阻礙了骨骼疾病蛋白質(zhì)組的研究。建立高效的骨蛋白提取技術(shù)是研究骨組織蛋白質(zhì)組的技術(shù)關(guān)鍵。本研究建立了適宜的骨蛋白提取技術(shù)，并通過多種提取方法的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)三氯醋酸(trichloroacetic acid， TCA)-丙酮沉淀法可獲得較高的骨蛋白提取率，且不受高豐度蛋白的影響，適合用于蛋白質(zhì)組的研究?，F(xiàn)對(duì)TCA-丙酮沉淀法進(jìn)行介紹，并將其與鹽酸脫鈣法[1]的提取效率進(jìn)行對(duì)比。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠(中國科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，3月齡，體重(200±20)g，在水合氯醛麻醉下，斷頭放血處死，在4℃預(yù)冷的75%醫(yī)用酒精中浸泡約20 min，在無菌條件下，取出股骨，剔除一切軟組織，液氮冷凍保存。

主要配制溶液(均為進(jìn)口分析純) 丙酮溶液Ⅰ：丙酮-20℃預(yù)冷(含w/v 10%三氯醋酸，v/v 0.07% β-巰基乙醇)；丙酮溶液Ⅱ：丙酮-20℃預(yù)冷(含v/v 0.07% β-巰基乙醇)；裂解液：8 mol/L 尿素、4% 3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、30 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷，使用前再加入1 mol/L二硫蘇糖醇65 μl/ml和1 mmol/L苯甲基磺酰氟。

儀器與設(shè)備EttanTM IPGPhor等電聚焦儀、Mini- phor垂直電泳系統(tǒng)、UMAX ImageScanner凝膠掃描儀、3300 proUV/VIS型紫外可見分光光度儀、雙向電泳圖像分析軟件ImageMaster 2D 6.0、2-D Quant Kit蛋白定量試劑盒均購自Amersham BioSciences公司。

TCA-丙酮沉淀法操作步驟(1)從液氮中取出股骨，用剪刀剪成1 mm2以下的小顆粒，冰水洗滌以清除骨髓造血組織，在預(yù)冷的研缽用液氮研磨20 min成粉，轉(zhuǎn)入5 ml離心管。(2)加入5倍體積的預(yù)冷丙酮溶液Ⅰ，邊振蕩邊逐滴加入，-20℃靜置，每隔20 min振蕩1次，每次約3 min，共4次，然后置于-20℃過夜。在4℃，×12 000 g，高速離心10 min，棄去上清液。(3)加入5倍體積的預(yù)冷丙酮溶液Ⅱ，操作同第(2)步，置于-20℃過夜。在4℃，×12 000 g，高速離心10 min，棄去上清液。0℃冰水中放置1h以揮發(fā)去除丙酮成干粉，-20℃保存。(4)每40毫克干粉加入800 μl裂解液，置于-20℃，每隔20 min振蕩1次，共3次，4℃冰箱過夜。在4℃，×12 000 g，高速離心20 min，吸取上清液，作為樣品1；剩余物再加入1 ml裂解液，4℃裂解過夜，如上法獲得樣品2；兩液分裝保存，以備分別測定濃度和電泳用。

鹽酸脫鈣法操作步驟參考文獻(xiàn)[1]并進(jìn)行改良，具體步驟如下：(1)將股骨研磨成粉放入1.2 mol/L鹽酸中，4℃脫鈣過夜(每0.2 g骨組織加1 ml鹽酸)，離心，吸取上清液作為提取液1；(2)沉淀物水洗后，每40毫克干粉加入800 μl裂解液，在4℃孵育72 h，離心后取上清液作為提取液2；(3)沉淀物加入包含0.5 mol/L EDTA-Na4的上述裂解液中，在4℃孵育72 h，離心后取上清液作為提取液3；(4)剩余物在6 mol/L鹽酸、4℃下孵育過夜，離心后，取上清液作為提取液4；(5)把提取物1～4，分別用丙酮在-20℃過夜以沉淀蛋白，在4℃，×12 000 g高速離心10 min，棄上清，獲得沉淀蛋白，加入裂解液過夜；(6)在4℃，×12 000 g高速離心20 min，吸取上清液，分裝保存，以備分別測定濃度和電泳用。

觀察指標(biāo)(1)對(duì)樣品提取前的干燥骨組織測重：由于鹽酸脫鈣法提取液4中多為高豐度蛋白，影響其他的蛋白鑒定，因此棄去提取液4。(2)在獲得提取液1、2、3后，分別丙酮沉淀，再加入裂解液4℃過液，獲得蛋白樣品1、2、3。TCA-丙酮沉淀法所獲得為蛋白樣品1、2。(3)蛋白濃度測定按照2-D Quant Kit蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行。采用紫外可見分光光度儀，測定吸光度，制作擬合曲線后，推算出蛋白質(zhì)樣品的濃度。(4)對(duì)兩種方法所提取蛋白，各取出適量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析。

結(jié) 果

蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果鹽酸脫鈣法與TCA-丙酮沉淀法提取骨蛋白具有相近的提取率，分別為8.25‰和7.82‰。僅從提取的骨量看，TCA-丙酮沉淀法可獲得較高的骨蛋白提取率(表1)。

SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果采用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)兩者進(jìn)行比較驗(yàn)證顯示，各個(gè)通道中蛋白條帶無論寬窄均清晰、無拖尾現(xiàn)象。其中TCA-丙酮沉淀法條帶分布均勻，條帶間隙清晰，條帶數(shù)明顯多于鹽酸脫鈣法；后者可能因樣品混合后沉淀形成，導(dǎo)致蛋白濃度降低，條帶顏色稍淡。泳道4～6每一條帶在泳道1～3的對(duì)應(yīng)位置均有相同條帶出現(xiàn)，箭頭所示條帶比1～3寬且顏色深；泳道7、8為血清蛋白對(duì)照，在1～6相同位置未見明顯的聚集(圖1)。

表 1 兩種提取方法所得蛋白樣品濃度對(duì)比

1～3. 三氯醋酸-丙酮沉淀法樣品1、2等量混合后所獲得蛋白的電泳圖(同一提取物的3個(gè)重復(fù))；4～6. 鹽酸脫鈣法樣品1、2、3等量混合后所獲得蛋白的電泳圖(同一提取物的3個(gè)重復(fù))；7、8. 血清蛋白的2個(gè)重復(fù)作為對(duì)照；箭頭所示條帶比1～3寬且顏色深1-3. the results of extractions 1 and 2 mixture by trichloroacetic acid-acetone precipitation method(three repeats of the same sample); 4-6. the results of extractions 1 and 2 and 3 mixture by hydrochloric acid decalcification method(three repeats of the same sample); 7,8. control group with 2 repeats of serum albumin；the band with arrow was wider and had deeper color than band 1 to 3

討 論

骨蛋白提取技術(shù)是骨蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)瓶頸，如何獲取最大的提取率、提全率和減少高豐度蛋白的影響是極需要解決的課題。由于骨組織硬度大，骨基質(zhì)中羥基磷灰石、高豐度的膠原和蛋白多糖含量高，而重要的非膠原性蛋白如各種生長因子、細(xì)胞因子和骨特異性蛋白等含量低，難以從骨組織中提出。傳統(tǒng)方法是把骨組織研磨成粉末，再用裂解液孵育。然而機(jī)械粉碎的方法很費(fèi)力，特別是大的動(dòng)物骨。更重要的是未脫鈣骨研磨后在裂解緩沖液中很易提取到大量膠原、蛋白多糖和大量金屬離子，影響等電點(diǎn)沉積，并影響對(duì)其他低豐度蛋白的全面檢測。

Jiang等[1]比較了鹽酸脫鈣法、單純裂解法和研磨后裂解法3種提取骨蛋白，結(jié)果骨蛋白提取率分別為8.25‰、0.73‰和3.31‰，鹽酸脫鈣后骨蛋白提取率為顯著提高；采用鹽酸脫鈣法通過自動(dòng)2D-LC-MS/MS分析儀可以提取6202種單肽，約對(duì)應(yīng)2479種蛋白單體，有助于骨蛋白質(zhì)組的全面分析；但該技術(shù)步驟復(fù)雜，需要分為4步提取骨蛋白，且各組分之間因酸堿度不同難以進(jìn)行混合，如采用雙向電泳進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組的研究，就大大增加了費(fèi)用和工作量，且酸浸泡使蛋白分解為多肽，不利于雙向電泳后的質(zhì)譜鑒定。王簕等[2]采用單純研磨法、單純錘擊法和錘擊研磨法分別對(duì)免骨組織蛋白進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)錘擊研磨法可獲取較高骨蛋白提取率，但需要特殊的錘式組織粉碎器。

TCA-丙酮沉淀法主要用于植物組織的蛋白提取。本研究首次將TCA-丙酮沉淀法用于骨蛋白的提取，結(jié)果表明該法可獲得7.82‰的蛋白提取率，與鹽酸脫鈣法有相近的提取率。從SDS-PAGE電泳圖看，泳道4～6每一條帶在泳道1～3的對(duì)應(yīng)位置均有相同條帶出現(xiàn)，表明TCA-丙酮沉淀法與鹽酸脫鈣法提取蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布基本一致。泳道4～6中僅箭頭所示條帶比1～3寬且顏色深，表明鹽酸脫鈣提取法僅在此相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)TCA-丙酮沉淀法有補(bǔ)充作用。泳道7、8為血清蛋白對(duì)照，在1～6相同位置未見明顯的聚集，表明所提蛋白未受到骨髓中造血組織污染(圖1)。因此認(rèn)為TCA-丙酮沉淀法可以用于雙向電泳中骨蛋白的提取，比較適合于骨組織蛋白質(zhì)組的研究。

在骨蛋白提取技術(shù)方面，尚需要進(jìn)一步的探索，如改進(jìn)裂解液的成份、增加裂解時(shí)間和震蕩次數(shù)、減小骨顆粒大小等。分步提取骨蛋白可對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分別提取，但也需對(duì)不同性質(zhì)的蛋白分別進(jìn)行研究，這需要根據(jù)研究者的目的進(jìn)行選擇。

[1] Jiang XG, Ye ML, Jiang XN, et al. Method development of efficient protein extraction in bone tissue for proteome analysis[J]. J Proteome Res, 2007, 6(6):2287-2294.

[2] 王簕，裴國獻(xiàn). 兔骨組織總蛋白的提取和在免疫印跡法中的應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)研究，2009，13(2)：137-141.

ApplicationofTrichloroaceticAcid-AcetonePrecipitationMethodforProteinExtractioninBoneTissue

CUI Yong-feng1, YANG Zhen2, ZHU Bao-hua1, XIAO Lu-wei2, TONG Pei-jian2

1Department of Orthopedics, the First People’s Hospital of Xiaoshan District, Hangzhou 311200, China
2Institute of Orthopedics, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China

CUI Yong-feng Tel:0571-83807651， E-mail: guke120@hotmail.com

ObjectiveTo explore the feasibility and efficiency of extracting protein from bone tissue using trichloroacetic acid (TCA)-acetone precipitation method.MethodsHydrochloric acid (HCL) decalcification method and TCA-acetone precipitation method were separately used for bone protein extraction. The efficiencies of these two methods were compared.ResultsTCA-acetone precipitation method had significantly higher extraction efficiency. Compared with HCL decalcification method, it had less pollution from bone marrow hematopoietic tissue. Protein band distribution was similar between these two methods.ConclusionTCA-acetone precipitation method is useful for bone proteomics research.

trichloroacetic acid-acetone precipitation method; bone tissue; protein extraction

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：210-213

崔永鋒 電話：0571-83807651, 電子郵件: guke120@hotmail.com

Q-34

A

1000-503X(2011)02-0210-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.022

中國博士后科學(xué)基金(20080431334)Supported by the China Postdoctoral Science Foundation(20080431334)

2010-07-02)