劉 芳 曹 陽， 孫長(zhǎng)坡 束長(zhǎng)龍

蘇云金芽孢桿菌對(duì)印度谷螟幼蟲的致死作用

劉 芳1曹 陽1，2孫長(zhǎng)坡2束長(zhǎng)龍3

(河南工業(yè)大學(xué)1，鄭州 450052)
(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院2，北京 10037)
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所3，北京 100094)

根據(jù)8株蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)的菌懸液對(duì)印度谷螟幼蟲的生物測(cè)定結(jié)果，篩選出5株對(duì)該幼蟲致死作用較好的Bt菌株。提取出5株Bt菌株的殺蟲晶體蛋白，再對(duì)印度谷螟幼蟲進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果表明:0．06 mL/g(飼料)的SC1－B3菌株殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲的致死率達(dá)到100%，同樣濃度的Bt33菌株殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲的致死率超過70%，其余3株Bt的殺蟲晶體蛋白致死率較低，致死率小于22．2%，但對(duì)印度谷螟幼蟲的羽化有明顯的抑制作用。

蘇云金芽孢桿菌 殺蟲晶體蛋白 印度谷螟 幼蟲

中國(guó)糧食儲(chǔ)備量巨大，居世界首位。糧食儲(chǔ)藏期較長(zhǎng)，儲(chǔ)藏期間儲(chǔ)糧害蟲造成的損失嚴(yán)重?；瘜W(xué)防治一直是儲(chǔ)糧害蟲防治的主要手段，但其在取得快速效果的同時(shí)，也引發(fā)了糧食污染、環(huán)境污染和害蟲抗性，以及損害工作人員身體健康等負(fù)面問題。發(fā)展綠色儲(chǔ)糧，保障生態(tài)和食品安全，已成為21世紀(jì)我國(guó)糧食儲(chǔ)藏實(shí)施可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略目標(biāo)［1］。

印度谷螟(Plodia interpunctella)是我國(guó)主要儲(chǔ)糧害蟲之一［2］，幼蟲食性復(fù)雜、習(xí)性隱蔽、善于爬行，成蟲飛行、繁殖能力強(qiáng)，對(duì)儲(chǔ)糧危害巨大，所以尋找高效、無污染的儲(chǔ)糧藥劑來防治印度谷螟極為必要。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是目前世界上產(chǎn)量最大、應(yīng)用最成功的微生物殺蟲劑。目前已分離的Bt菌株超過了5萬株，Bt菌株的殺蟲范圍已經(jīng)擴(kuò)大到包括大量農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲在內(nèi)的無脊椎的4個(gè)門和節(jié)肢動(dòng)物門中9個(gè)目的生物［3］。大部分Bt菌株在芽孢形成過程中可以產(chǎn)生由δ－內(nèi)毒素組成的晶體狀內(nèi)含物，又稱為殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，簡(jiǎn)稱 ICPs)，其含量可以占到芽孢形成過程中菌體產(chǎn)生總蛋白的20%～30%，是蘇云金芽孢桿菌中最主要的殺蟲活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)Bt可以對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動(dòng)物等具有特異性的殺蟲活性［4］。殺蟲晶體蛋白對(duì)環(huán)境無毒無害，且在動(dòng)物胃腸道內(nèi)的酸性環(huán)境下才能溶解起到殺蟲作用。在人體內(nèi)沒有靶標(biāo)，對(duì)人畜無害，所以是一種安全高效的生物殺蟲劑［5］。

國(guó)外已有關(guān)于Bt菌株及其殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲影響的研究［6－8］，國(guó)內(nèi)對(duì)此方面的研究較少，黃衍章等［9］在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Bt菌株對(duì)印度谷螟幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用，但Bt菌株對(duì)印度谷螟的致死作用沒有很好的效果。本試驗(yàn)采用8種Bt菌株對(duì)印度谷螟幼蟲進(jìn)行生物測(cè)定試驗(yàn)，篩選出5株高效的Bt菌株。通過擴(kuò)大培養(yǎng)，提取殺蟲晶體蛋白，用Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲進(jìn)行生物測(cè)定，以期為我國(guó)今后防治印度谷螟提供參考方法。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 材料

印度谷螟1齡、3齡幼蟲由國(guó)家糧食局科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)。印度谷螟飼料配比見表1。

表1 人工印度谷螟飼料配比

Bt菌株 MO3 － A5、MO3 － G4、B7、Bt33、Bt35、SC1－B3、SC1－A11、B4，8株菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1．1．2 試驗(yàn)儀器和設(shè)備

DGG－9140BD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn);恒溫恒濕培養(yǎng)室:國(guó)家糧食局科學(xué)研究院;ST70雙目體式顯微鏡:舜宇儀器有限公司;AKATA Explorer葡聚糖凝膠G50脫鹽柱以及蛋白分析系統(tǒng):瑞典Pharmacia公司，Mini－protean 4蛋白電泳系統(tǒng):美國(guó)bio－rad伯樂公司。

1．2 方法

1．2．1 Bt菌懸液制備

活化待測(cè)8株蘇云金芽孢桿菌，以1% 接種量轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中(3%牛肉膏，5%蛋白胨，pH 7．0，121 ℃滅菌 20 min)，30 ℃，230 r/min 培養(yǎng)至芽孢晶體分離，離心收集菌體，用培養(yǎng)基1/10體積無菌水懸浮孢晶混合物，4℃保存待測(cè)。

1．2．2 印度谷螟的飼養(yǎng)方法

將羽化1～2 d的印度谷螟成蟲，接入到產(chǎn)卵器中。2 d后將蟲卵取出，在體式鏡下檢查蟲卵的質(zhì)量，挑取完好的蟲卵備用。

按表1配制飼料，然后將蟲卵接入飼料中。放入光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)(28℃，75%RH)，每天觀察生長(zhǎng)情況。羽化1～2 d后，重復(fù)以上過程擴(kuò)大培養(yǎng)。

1．2．3 Bt菌懸液對(duì)印度谷螟幼蟲的毒力測(cè)定

將8株Bt菌懸液與配制好的印度谷螟飼料以0．167 mL/g濃度的混合，空白對(duì)照組飼料與無菌水以同樣比例混合，取3 g放入小玻璃瓶中，每瓶接入5頭印度谷螟3齡幼蟲，6組重復(fù)。放到溫度30℃，相對(duì)濕度75%，光照12 h/d的條件下恒溫恒濕培養(yǎng)室飼養(yǎng)，20 d后記錄試蟲的羽化及死亡情況。

1．2．4 殺蟲晶體蛋白的提取

在30℃條件下活化所要的5株Bt菌株12 h。然后將5株菌株分別轉(zhuǎn)入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(30℃，120 r/min，搖36 h)。鏡檢，菌體裂解，晶體釋放，菌液離心(8 000 r/s，10 min)，棄上清液。將沉淀物用蒸餾水懸起，離心，棄上清。沉淀物用1 mol/L NaCl懸起，超聲波破碎5 min，離心(8 000 r/s，10 min)，棄上清液。沉淀物用10 mL蒸餾水懸起，加入等體積的蛋白裂解液(100 mmol/L Na2CO3/NaHCO3，20 mmol/L DTT，pH 10．5)室溫孵育 1 h，離心取上清。上清液利用葡聚糖凝膠G50脫鹽柱(GE)除去DTT與小分子物質(zhì)后置于－20℃冰箱待測(cè)。得到所需要的目的蛋白，SDS－PAGE電泳，SDS－PAGE電泳參照 bio－rad，Mini－protean 4說明進(jìn)行。

1．2．5 Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟的毒力測(cè)定

將5株Bt殺蟲晶體蛋白與配制好的印度谷螟飼料以0．06 mL/g比例混合，空白對(duì)照組飼料與無菌水以同樣濃度混合，分別取9 g放入小玻璃瓶中，接入15頭印度谷螟1齡幼蟲，3組重復(fù)。放到溫度30℃，相對(duì)濕度75%，光照12 h/d的恒溫恒濕培養(yǎng)室飼養(yǎng)，每天記錄試蟲的羽化及死亡情況。

1．2．6 數(shù)據(jù)處理方法

校正死亡率計(jì)算公式:

校正死亡率=(實(shí)驗(yàn)組死亡率－對(duì)照組死亡率)/(1－對(duì)照組死亡率)×100%

平均校正死亡率的標(biāo)準(zhǔn)誤差及顯著性分析采用DPSv7．05專業(yè)版軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2．1 Bt菌株對(duì)印度谷螟幼蟲的致死結(jié)果

8種Bt菌懸液對(duì)印度谷螟3齡幼蟲進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 8株Bt菌株對(duì)印度谷螟3齡幼蟲處理20 d的致死率(0．167 mL/g)

由表2看出，8株菌株的懸菌液對(duì)印度谷螟幼蟲都有一定的致死效果，SC1－B3菌株對(duì)印度谷螟幼蟲校正致死率達(dá)到93．3%，與對(duì)照及其他幾組有顯著差異。Bt33、MO3 －A5、SC1 －A11、B7，4 株 Bt菌株對(duì)印度谷螟幼蟲的致死率都在30%～50%之間，4株菌株間差異不顯著，與對(duì)照組差異顯著。以上結(jié)果表明4株Bt菌株對(duì)印度谷螟幼蟲有一定的致死效果，但效果不顯著。其中MO3－G4、Bt35、B4，3株Bt菌株對(duì)印度谷螟幼蟲的致死率小于20%，與對(duì)照差異不顯著，說明這3株Bt菌株對(duì)印度谷螟幼蟲毒力效果不明顯。因此后續(xù)殺蟲蛋白提取研究選用 SC1－B3、Bt33、MO3－A5、SC1－A11、B7，5株菌株。

2．2 殺蟲晶體的分析

提取Bt菌株產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白，并進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

圖1 5株Bt蛋白的SDS－PAGE電泳圖

從圖1可以看出5株Bt殺蟲晶體蛋白(SC1－B3、Bt33、MO3－A5、SC1 －A11、B7)都有明顯條帶出現(xiàn)，證明Bt殺蟲晶體蛋白制備成功。

2．3 Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲的生物測(cè)定結(jié)果

2．3．1 Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲化蛹的影響

使用5株殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟1齡幼蟲進(jìn)行了生物測(cè)定試驗(yàn)，并將9組45頭試蟲的羽化時(shí)間與羽化率用Excel折線圖進(jìn)行分析(圖2)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組的羽化時(shí)間比對(duì)照組的羽化時(shí)間延長(zhǎng)很多。

圖2 不同Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟羽化時(shí)間影響

從圖2中看出對(duì)照組從22 d開始羽化，到26 d時(shí)羽化率開始保持不變，證明除了個(gè)別自然死亡的試蟲外，其余全部羽化。而試驗(yàn)組在第26 d的時(shí)候羽化率為0% ～20%，到33 d后羽化率保持不變。除了SC1－B3這株菌株致死率達(dá)到100%，其余4株Bt殺蟲晶體蛋白都出現(xiàn)羽化時(shí)間延長(zhǎng)情況，說明印度谷螟幼蟲在取食殺蟲晶體蛋白后，Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲有一定的毒力作用，并可以起到抑制其化蛹，延長(zhǎng)其羽化時(shí)間的作用。

2．3．2 殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲毒力效果分析

5株殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟1齡幼蟲進(jìn)行毒力測(cè)定試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果保持不變后，統(tǒng)計(jì)死亡率，結(jié)果見表3。

表3 Bt蛋白對(duì)印度谷螟1齡幼蟲處理35 d的致死率(0．06 mL/g)

從表3中可見，5組試驗(yàn)的死亡數(shù)都比對(duì)照組的高，證明5株殺蟲晶體蛋白都在一定程度上對(duì)印度谷螟有致死作用，其中SC1－B3和Bt33這兩株Bt殺蟲晶體蛋白的致死率分別達(dá)到100%和73．3%，與對(duì)照組差異顯著，毒力效果很好。其余3株Bt殺蟲晶體蛋白的致死率均未超過30%，與對(duì)照組差異不顯著，毒力效果不明顯。

3 討論與結(jié)論

迄今為止，我國(guó)對(duì)Bt殺蟲晶體蛋白的研究只停留在對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲的研究和應(yīng)用上，韓嵐嵐等［10］將幾種Bt殺蟲晶體蛋白在對(duì)小菜蛾幼蟲的活性測(cè)定中，得到很好的毒力效果。另外在大田應(yīng)用上也取得了很好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。而在儲(chǔ)糧害蟲防治上研究和應(yīng)用均很緩慢。雖然利用蘇云金芽孢桿菌防治印度谷螟已有報(bào)道，但多停留在試驗(yàn)階段，將Bt殺蟲晶體蛋白應(yīng)用到儲(chǔ)糧害蟲的研究還未見報(bào)道，離市場(chǎng)化仍具有較大的差距［11］。

本試驗(yàn)通過對(duì)Bt菌株及Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟幼蟲的生物測(cè)定，篩選出2株毒力效果很好的殺蟲晶體蛋白，而且發(fā)現(xiàn)殺蟲晶體蛋白對(duì)印度谷螟的化蛹起到一定的抑制作用，下一步將這幾株Bt菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，制成Bt殺蟲晶體蛋白干粉，進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)倉試驗(yàn)，再逐步推向市場(chǎng)化，這將大大提高我國(guó)儲(chǔ)糧上防治印度谷螟的效果，推動(dòng)我國(guó)儲(chǔ)糧害蟲綠色防治技術(shù)的發(fā)展。

［1］王平坪，李燕羽，張軍黨，等．惰性粉殺蟲劑在綠色儲(chǔ)糧中的應(yīng)用［J］．糧油儲(chǔ)藏，2008，33(2):33 －35

［2］孟永青．蛾類儲(chǔ)糧害蟲的主要種類及防治方法［J］．西部糧油科技，2002，27(1):49 －50

［3］王廣君．高效廣譜蘇云金芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建及殺蟲晶體蛋白的研究［D］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2005

［4］鄭大勝，閆建平，羅紹彬，等．新型殺蟲蛋白VIPs研究進(jìn)展［J］．微生物學(xué)雜志，2001，22(3):35 －37

［5］曹正明．蘇云金芽孢桿菌與現(xiàn)代生物農(nóng)藥［J］．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，2(20):140 －142

［6］Johnson D E，Oppert B，McGaughey W H．Spore Coat Protein Synergizes Bacillus thuringiensis Crystal Toxicity for the Indianmeal Moth(Plodia interpunctella)［J］．Current Microbiology，1998，36(5):278 －282

［7］Johnson D E，McGaughey WH．Contribution of Bacillus thuringiensisspores to toxicity of purified cry proteins Indian meal moth larva［J］．Current Microbiology，1996，33(1):54 －59

［8］Corina M B，Graciela L S．Characterization of Bacillus thuringiensis isolates from Argentina that are potentially useful in insect pest control［J］．BioControl，2006，51(6):779 －794

［9］黃衍章，李世廣，王轉(zhuǎn)紅．蘇云金芽孢桿菌對(duì)印度谷螟幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響［J］．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29(2):148－151

［10］韓嵐嵐，戴長(zhǎng)春，宋福平，等．幾種蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白對(duì)黑龍江省主要蔬菜害蟲小菜蛾活性分析［J］．植物保護(hù)，2008(8):198 －200

［11］吳繼星，陳在佴，李青，等．蘇云金桿菌研究進(jìn)展［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，1(6):43 －45．

Lethality of Bacillus Thuringiensis to Larvae of Plodia Interpunctella

Liu Fang1Cao Yang1，2Sun Changpo2Shu Changlong3
(Henan University of Tech－nology1，Zhengzhou 450052)
(Academy of State Administration of Grain2，Beijing 100037)
(Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences3，Beijing 100094)

The bacterial suspensions of eight strains of Bacillus thuringiensis(Bt)against the Plodia interpunctella larva have been carried out in this paper．The five strains of high effective Bt were selected among 8 strains．After the insecticidal crystal protein(ICP)of the 5 strains has been extracted，the toxicity of ICP to the larva of P．interpunctella have been assayed．The results indicated that the lethality of the larva was 100%by using ICPof SC1 －B3 strains at 0．06 mL/g concentration．It was more than 70%lethality by using ICPof Bt33 strains，and it was less than 22．2%lethality by using ICP of other 3 strains，at same concentration．

Bacillus thuringiensis，insecticidal crystal proteins，Plodia interpunctella

Q965．9

A

1003－0174(2011)09－0079－04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2009BADAOB005－3)

2010－11－16

劉芳，女，1986年出生，碩士，農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治

曹陽，男，1958年出生，研究員，糧油倉儲(chǔ)科技