李 覃，陳 虹，韋 娜，梅 昕，那春祺，劉永峰，胡 杰

(1.天津武警醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，2.天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.天津武警醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室，天津 300162)

接觸性皮炎是皮膚和外物接觸后誘發(fā)的急、慢性炎癥反應(yīng)，分為化學(xué)刺激引起的刺激性接觸性皮炎(irritation contact dermatitis，ICD)和免疫反應(yīng)引起的變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)。對(duì)于ICD，找到病因避免接觸則較易治愈;而對(duì)于ACD，由于許多患者不能圓滿改善與變應(yīng)原接觸的現(xiàn)狀，或者未得到正確的診斷與治療，常導(dǎo)致病情遷延難愈。而且，隨著經(jīng)濟(jì)和現(xiàn)代工業(yè)化的發(fā)展、環(huán)境污染的加重，ACD發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)。目前，ACD的常用治療藥物均有不同程度毒副作用，因此，研制療效好、副作用小的新型干預(yù)藥物就顯得尤為迫切和重要。青蒿素(artemisinin，Art)是從菊科植物黃花蒿葉中提取的一種含有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯，在臨床上已被廣泛用于治療瘧疾，具有高效低毒的特點(diǎn)［1］。多年來(lái)的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素殺滅瘧原蟲的作用與其免疫調(diào)節(jié)活性相關(guān)［2］。現(xiàn)已證實(shí)，Art對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病以及二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)誘導(dǎo)的小鼠ACD都能顯示出不同程度的治療或保護(hù)作用，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)在建立小鼠實(shí)驗(yàn)性ACD模型的基礎(chǔ)上，局部外涂Art進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)檢測(cè)Treg、Th17細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子、相關(guān)細(xì)胞因子以及信號(hào)分子，探索Art對(duì)ACD小鼠Treg/Th17免疫平衡的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 Art(純度99.5%)購(gòu)于鄭州荔諾生物科技發(fā)展有限公司;DNFB購(gòu)于Sigma公司;TRIzol試劑購(gòu)于Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司;小鼠Treg試劑盒購(gòu)于eBioscience公司;STAT3及其磷酸化抗體phospho-STAT3(Ser727)購(gòu)于Bioworld公司;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購(gòu)于Pierce公司;IL-6、IL-10、IL-17的ELISA試劑盒購(gòu)于R＆D公司;ICR小鼠(6～8周齡，♀)購(gòu)于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證SCXK-(軍)2007-004。

1.2 動(dòng)物模型的建立及給藥方法 參照文獻(xiàn)方法［3］建立ACD小鼠模型:實(shí)驗(yàn)前1日將每鼠腹部去毛，去毛范圍約為3 cm×3 cm。開始日(d 0)和d 1每日于去毛部位涂0.5%DNFB(以4∶1丙酮橄欖油配制)40 μl分別致敏1次。d 6于左耳內(nèi)外側(cè)涂0.3%DNFB 20 μl激發(fā)。誘發(fā)前0.5 h和誘發(fā)后6 h小鼠左耳外涂Art乳膏(本室自制，Art濃度分別為2%、4%、8%)。激發(fā)后48 h處死小鼠。取一組模型小鼠外涂乳膏基質(zhì)作為基質(zhì)對(duì)照以排除基質(zhì)對(duì)ACD的影響。

1.3 RT-RCR 檢測(cè) Foxp3、ROR-γt的 mRNA 表達(dá)

收集各組小鼠引流淋巴結(jié)，提取組織RNA，檢測(cè)A260/A280比值在1.8～2.0。引物序列由金思特科技有限公司合成如下:Foxp3(424 bp):上游引物5'-ACGCCCCAACAAGTGCTCCA-3'，下游引物 5'-TGGCAGTGGCCAAGGCAGAT-3';ROR-γt(291 bp):上游引物5'-TGAACTTGGGGAACCAGAAC-3'，下游引物5'-TTGGCAAACTCCACCACATA-3';GAPDH(225 bp):上游引物5'-TGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物 5'-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3'。按照Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成。PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 30 s，共 34 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)用Gel-Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定各組條帶。

1.4 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)IL-6、IL-10、IL-17含量 收集模型及給藥干預(yù)各組小鼠耳組織，置于含0.1%Tween 20的PBS中勻漿，取上清，按試劑盒推薦的步驟，用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子含量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù) 按文獻(xiàn)方法［4］收集、純化各組小鼠淋巴結(jié) T細(xì)胞，以 staining buffer洗滌 3次(2 000 r·min－1，5 min/次)，根據(jù)試劑盒推薦的步驟，以抗-CD4和抗-CD25抗體進(jìn)行表面標(biāo)記，4℃避光孵育30 min，洗滌3次，固定、破膜后加入抗Foxp3及相應(yīng)的同型對(duì)照，4℃，避光孵育30 min，洗滌后以staining buffer重懸細(xì)胞，Backmen流式細(xì)胞儀上機(jī)分析。FITC為熒光1通道(FL1)，PE為熒光2通道(FL2)，PE-Cy5為熒光4通道(FL4)，采用SystemⅡTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 Western blot檢測(cè)STAT3的活性表達(dá) 收集各組小鼠淋巴結(jié)，提取組織蛋白，Bradford法定量蛋白含量，SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(Phospho-STAT3，1∶1 000)孵育，4℃過(guò)夜，TBST洗膜后以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL法檢測(cè)。用Stripping Solution洗脫、封閉后，再次加入一抗(STAT3，1∶1 000)、二抗，顯影。采用 BioRad系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 Art調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞特異性核因子的基因表達(dá) Foxp3與ROR-γt分別是Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的特異性標(biāo)志和特異性轉(zhuǎn)錄因子，在相應(yīng)T細(xì)胞亞群的分化過(guò)程中起重要作用［5］。為探討Art對(duì)Treg/Th17免疫平衡的調(diào)節(jié)作用，采用RT-PCR檢測(cè)Foxp3和ROR-γt的基因表達(dá)。Art作用后，F(xiàn)oxp3的mRNA表達(dá)增加，尤以中、高劑量組明顯;同時(shí)ROR-γt的mRNA表達(dá)明顯下降(Fig 1)?？梢?jiàn)，在DNFB誘導(dǎo)的ACD小鼠中，Art能夠通過(guò)影響Foxp3和ROR-γt基因表達(dá)抑制Th17細(xì)胞分化、誘導(dǎo)Treg生成，從而調(diào)節(jié)Treg/Th17免疫平衡。

Fig 1 Effect of artemisinin(Art)on the expression of Foxp3 and ROR-γt1:Marker;2:Normal;3:Vehicle;4:2%Art;5:4%Art;6:8%Art.Art:artemisinin;Normal:normal mice;Vehicle:vehicle group without Art.

2.2 Art對(duì)Treg/Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 2)，與正常組比較，基質(zhì)對(duì)照組IL-17含量明顯增高，而IL-10則明顯降低(P＜0.05)。Art作用后，Treg/Th17相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生顯示出不同程度的變化，與基質(zhì)對(duì)照相比，Art能有效抑制IL-17的產(chǎn)生，且呈一定的劑量依賴性，然而 Art對(duì) IL-10產(chǎn)生無(wú)影響(P＞0.05)。

2.3 Art對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Treg亞群的調(diào)節(jié)作用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)(Fig 3)，高劑量Art作用后，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞約占6.14%，與基質(zhì)對(duì)照組(5.08%)相比明顯升高，但中、低劑量Art則下調(diào)Treg的產(chǎn)生(P＜0.05)，提示高劑量Art對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Treg亞群有促增殖效應(yīng)，而中、低劑量的 Art則抑制 CD4+CD25+Foxp3+Treg的增殖分化。

2.4 Art抑制IL-6及Phospho-STAT3的活性表達(dá)

炎癥部位IL-6含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，高劑量Art明顯抑制ACD小鼠的IL-6產(chǎn)生，中、低劑量組的差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。Western檢測(cè)結(jié)果表明，Art能有效減弱p-STAT3的活性表達(dá)，同時(shí)不影響相應(yīng)的非磷酸化抗體的蛋白表達(dá)(Fig 4)。

Fig 2 Effect of Art on IL-10 and IL-17A:The production of IL-17;B:The production of IL-10.＊＊P＜0.01 vs vehicle group

3 討論

ACD的病理過(guò)程主要為T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。傳統(tǒng)上根據(jù)分化和功能特征可將CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2細(xì)胞，正常情況下Th1/Th2免疫應(yīng)答處于動(dòng)態(tài)平衡，一旦該模式向Th1偏移時(shí)會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)和組織損傷，ACD一度被認(rèn)為與Thl型免疫反應(yīng)相關(guān)。目前對(duì)ACD的發(fā)病機(jī)制仍存在不少爭(zhēng)議，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Th1應(yīng)答能夠治療ACD，但也有報(bào)道指出，可以通過(guò)糾正Th2偏移控制ACD［6－7］。最近研究表明，ACD 的細(xì)胞因子反應(yīng)模式與過(guò)敏原類型、接觸途徑等因素有關(guān)，如在DNFB誘導(dǎo)的ACD中T細(xì)胞向Th1分化偏移，而異硫氰酸熒光素(FITC)誘導(dǎo)的ACD中T細(xì)胞則向Th2偏移［6］，因此ACD的發(fā)病過(guò)程可能同時(shí)涉及 Th1和Th2細(xì)胞，兩者在疾病發(fā)展的不同階段可能呈交互出現(xiàn)。

Fig 3 Effect of Art on the generation of Treg

以往研究報(bào)道，無(wú)論DNFB還是FITC誘導(dǎo)的ACD動(dòng)物模型，CD4+T細(xì)胞都能降低ACD發(fā)生，然而對(duì)CD4+T細(xì)胞減弱過(guò)敏原引發(fā)炎癥的原因尚不清楚，直到Sakaguchi等［8］發(fā)現(xiàn)和提出調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)的存在。現(xiàn)已明確，過(guò)激的免疫應(yīng)答(如遲發(fā)型超敏反應(yīng))不僅有效應(yīng)性T細(xì)胞活化，還伴隨著Treg的形成，Treg和效應(yīng)細(xì)胞之間的平衡是免疫系統(tǒng)控制免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，Treg功能低下甚至可以成為導(dǎo)致ACD發(fā)生的重要原因［9］。新近證實(shí)，抗炎劑可通過(guò)誘導(dǎo)Treg明顯減輕小鼠的接觸性超敏反應(yīng)［10］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，Art不但對(duì)DNFB誘導(dǎo)的ACD小鼠耳腫脹有明顯抑制效應(yīng)，而且能夠劑量依賴性地促進(jìn) TGF-β產(chǎn)生［11］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察Art對(duì)Treg細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)Art能劑量依賴性地上調(diào)ACD小鼠的Foxp3表達(dá)。已有文獻(xiàn)報(bào)道表明，較低劑量的Art能夠增強(qiáng)小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，對(duì)免疫功能重建起到一定作用［12］;而高劑量Art則具有廣泛的免疫抑制作用［13］。本研究結(jié)果提示，高劑量Art可以通過(guò)誘導(dǎo)Treg發(fā)揮免疫抑制作用，而較低劑量的Art則抑制Treg的產(chǎn)生，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致?？梢?jiàn)，Art的這種雙相免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)或許與藥物劑量、給藥途徑以及機(jī)體狀態(tài)等多種因素有關(guān)。

Fig 4 Inhibitory effect of Art on IL-6 level and phosphorylated-STAT3 expressionA:The production of IL-6;B:The expression of phosphorylated-STAT3.＊＊P ＜0.01 versus vehicle group.1:Normal;2:Vehicle;3:2%Art;4:4%Art;5:8%Art

Th17細(xì)胞是人們新近發(fā)現(xiàn)的以IL-17為主要效應(yīng)因子的新型CD4+T細(xì)胞亞群，參與機(jī)體多種炎癥和免疫性疾病的發(fā)生［14］。有報(bào)道指出，ACD患者皮損部位可見(jiàn)大量Th17細(xì)胞浸潤(rùn)、IL-17表達(dá)增加［5］。Th17的發(fā)現(xiàn)彌補(bǔ)了Th1/Th2介導(dǎo)ACD免疫效應(yīng)機(jī)制的不足。IL-6是重要促炎因子，一般認(rèn)為，IL-6和TGF-β是誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，兩者同時(shí)存在時(shí)，會(huì)促進(jìn)Th17細(xì)胞生成的正反饋環(huán)路，使初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化并產(chǎn)生 IL-17，后者進(jìn)一步促進(jìn) IL-6的產(chǎn)生［15］。參與IL-17產(chǎn)生的一個(gè)重要的信號(hào)分子是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)，能被IL-6經(jīng)由細(xì)胞膜受體gpl30/II-6Ra活化，進(jìn)而與酪氨酸磷酸化信號(hào)通路偶聯(lián)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［16］。本實(shí)驗(yàn)及課題組前期研究結(jié)果顯示［11］，Art明顯抑制ACD小鼠高表達(dá)的 ROR-γt及 IL-17 的產(chǎn)生，上調(diào) TGF-β，從而進(jìn)一步促進(jìn)Treg細(xì)胞的生成。另一方面，Art還能抑制IL-6水平及STAT3的活性表達(dá)，隨著IL-6的降低，增加的TGF-β又能通過(guò)擴(kuò)增、維持Treg細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞的功能維持在合適狀態(tài)，從而有效控制ACD的發(fā)病過(guò)程。

以往認(rèn)為，ACD的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制主要是Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答，Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)拓寬了對(duì)ACD形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)，有助于解釋Th1/Th2軸中異?，F(xiàn)象發(fā)生的原因。Th17在分化和功能上能夠與Treg相互轉(zhuǎn)化，TGF-β可誘導(dǎo)初始 T細(xì)胞分化為Treg并抑制免疫應(yīng)答;而在IL-6存在情況下，TGF-β則促進(jìn)Th17細(xì)胞生成并分泌IL-17，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生?？梢?jiàn)，Th1/Th2細(xì)胞、Treg/Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子間免疫平衡的破壞對(duì)ACD的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用，調(diào)控Treg/Th17之間的平衡，可能為有效治療ACD提供一個(gè)新的途徑。

總之，本研究顯示Art具有良好的免疫抑制活性，對(duì)DNFB誘導(dǎo)的小鼠ACD具有保護(hù)作用，推測(cè)低濃度的TGF-β和IL-6的協(xié)同作用能誘導(dǎo)Th17細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt產(chǎn)生，增加Th17細(xì)胞數(shù)量;而高濃度TGF-β則上調(diào)Foxp3表達(dá)，影響IL-17產(chǎn)生進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞分化。據(jù)此認(rèn)為，在DNFB誘導(dǎo)的ACD中，IL-6的明顯增多使初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，Art通過(guò)下調(diào)炎癥組織中的IL-6、IL-17，抑制 ROR-γt表達(dá)，上調(diào) TGF-β 與 Foxp3，從而抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生;另一方面，當(dāng)Art干預(yù)后，TGF-β水平升高，IL-6水平降低，增高的 TGF-β可促使 Treg細(xì)胞增多、抑制 Th17細(xì)胞分化。同時(shí)Treg細(xì)胞還可抑制Th17細(xì)胞及IL-17的活性，使炎癥反應(yīng)減輕。此外，在Art阻止IL-6誘導(dǎo)Th17細(xì)胞并促進(jìn)抗炎性Treg的分化中，其對(duì)STAT3信號(hào)途徑的阻斷似乎是關(guān)鍵因素，然而STAT3能否成為Art治療ACD的有效靶位尚需進(jìn)一步研究。

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