高效降解廢棄蓖麻基潤滑油降解菌的分離篩選及特性研究

劉亞瓊， 王昌祿， 何 東， 張麗紅， 陳勉華， 王玉榮，何良年， 葉 鋒

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457;2.南開大學(xué)蓖麻工程研究中心，天津 300071)

編者按:清潔生產(chǎn)是一個(gè)系統(tǒng)工程，其核心是“節(jié)能、降耗、減污、增效”.利用清潔生產(chǎn)理念與先進(jìn)技術(shù)改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，將污染物削減以至消除在生產(chǎn)過程中，將成為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)走新型工業(yè)化道路的重要途徑.推行清潔生產(chǎn)，對食品工業(yè)調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長方式，實(shí)施可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，具有重要意義.本期刊登的這篇文章，在工藝及設(shè)備方面對食品行業(yè)的清潔生產(chǎn)工作，做了一些實(shí)際探索，可圈可點(diǎn).(欄目主持人:宋煥祿教授)

高效降解廢棄蓖麻基潤滑油降解菌的分離篩選及特性研究

劉亞瓊1， 王昌祿1， 何 東1， 張麗紅1， 陳勉華1， 王玉榮1，何良年2， 葉 鋒2

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457;2.南開大學(xué)蓖麻工程研究中心，天津 300071)

從內(nèi)蒙古某蓖麻榨油廠排污口采樣，分離篩選出10株能降解廢棄蓖麻基潤滑油菌株，其中T-9菌株降解潤滑油的能力較強(qiáng)，該菌株最適降解pH值為5.0，降解溫度30℃，在1% ～5%的NaCl中能較好生長.通過菌落形態(tài)與生理生化實(shí)驗(yàn)，初步鑒定該菌株為假單胞菌屬(Pseudomonas).在潤滑油質(zhì)量濃度為10 g/L，初始pH值為5.0，180 r/min，30℃下培養(yǎng)7 d后，采用改進(jìn)的CEC-L-33-A-93方法測得其對廢棄蓖麻基潤滑油的降解率為72%.采用GC/MS對降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，測得其對廢棄蓖麻基潤滑油降解率為80%，該菌株具有良好的蓖麻基潤滑油降解能力.

蓖麻基潤滑油;CEC-L-33-A-93方法;GC/MS;降解特性

隨著潤滑油的廣泛使用，人們越來越關(guān)注它對環(huán)境產(chǎn)生的影響［1］，潤滑油在使用過程中，不可避免地會通過泄漏、溢出或不恰當(dāng)?shù)呐欧诺韧緩竭M(jìn)入環(huán)境，而這些油品中的大多數(shù)組分不能被生物降解，且具有一定的生態(tài)毒性，嚴(yán)重污染大氣、土壤和水資源，破壞生態(tài)環(huán)境和生態(tài)平衡［2］.石油污染土壤的治理方法主要有物理法、化學(xué)法及生物修復(fù)技術(shù)，其中生物修復(fù)技術(shù)被認(rèn)為最有生命力.目前，大多數(shù)研究是通過添加N、P等營養(yǎng)物質(zhì)刺激土壤中土著微生物的活性來實(shí)現(xiàn)污染土壤的生物修復(fù)［3－4］，但由于土著微生物生長緩慢、數(shù)量有限，往往使生物修復(fù)過程受到限制.

向石油污染土壤中投加環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)、降解效能高的菌種或菌群是提高石油污染土壤生物修復(fù)效率的主要手段.可生物降解潤滑油的研究主要包括基礎(chǔ)油、添加劑和生物降解性能試驗(yàn)方法等［5－7］，目前，對于生物降解標(biāo)準(zhǔn)研究甚少.

本研究從內(nèi)蒙古蓖麻榨油車間排污口采取土樣和水樣，分離菌株，對其形態(tài)及生理生化特性進(jìn)行研究，對CEC-L-33-A-93方法［8］進(jìn)行了改進(jìn)，使其培養(yǎng)周期縮短，根據(jù)潤滑油的溶解性選擇合適的萃取劑，確保潤滑油結(jié)構(gòu)官能團(tuán)在2 930 cm－1處有特征吸收峰.研究菌株的生理生化特性及降解后產(chǎn)物的分析，為深入進(jìn)行降解機(jī)理研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品來源及培養(yǎng)基

從內(nèi)蒙古蓖麻榨油車間排污口采取土樣和水樣;廢棄蓖麻基潤滑油由南開大學(xué)蓖麻工程研究中心提供.

礦物降解培養(yǎng)基:KH2PO43.4 g;Na2HPO41.5 g;(NH4)2SO44.0 g;MgSO40.7 g;NaCl 1.6 g;酵母粉0.01 g;Tween-80 0.6 mL，蓖麻基潤滑油5.0 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0 ～7.2，121 ℃滅菌20 min.

富集培養(yǎng)基:葡萄糖3 g;NaCl 5 g;酵母膏3 g;蛋白胨3 g;K2HPO4·3H2O 2.7 g;蒸餾水1 000 mL;pH值為7.2;115℃滅菌15 min.

1.2 降解菌的分離篩選

將采集的樣品經(jīng)24 h曝氣處理后，在無菌操作條件下取少量樣品，加入50 mL無菌水，攪拌，制成懸浮液.用移液槍取0.1 mL懸浮液，放入以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器連續(xù)涂布4個(gè)平板，分別放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中.培養(yǎng)2～3 d，挑取生長較快和不同菌落形態(tài)的菌株，進(jìn)一步分離純化復(fù)篩，從中篩選出能以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源生長的菌株.

1.3 降解特性的研究

從篩選的T-9菌株斜面培養(yǎng)基中，挑取一環(huán)接種于LB液體活化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，分別取1 mL加入不同初始 pH 值(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)的礦物降解培養(yǎng)基中，180 r/min，培養(yǎng)12 h后，測定不同初始pH值時(shí)生物量，獲得最適pH值.同理，在不同培養(yǎng)溫度:15，20，25，30，35，40 ℃環(huán)境中，180 r/min，培養(yǎng)12 h后，測定不同培養(yǎng)溫度時(shí)生物量，獲得最適生長溫度.在培養(yǎng)條件一致情況下，在250mL三角瓶中裝入100mL富集培養(yǎng)基，將菌株T-9以相同接種量接入NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，3%，5%，7%，9%的富集培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min，培養(yǎng)3 d.用紫外及可見分光光度計(jì)測試OD600值.

1.4 菌落形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)

在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上觀察菌株T-9的菌落特征，觀察生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步確定菌株的分類地位［9］.

1.5 蓖麻基潤滑油降解實(shí)驗(yàn)

1.5.1 培養(yǎng)基:見1.1

1.5.2 錐形瓶的準(zhǔn)備

測試需要的不同種類測試燒瓶制備中各添加物的含量見表1.

表1 測試瓶樣品的制備Tab.1 Preparation of test bottles

1.5.3 測試三角瓶最小數(shù)量的確定

測試需要的不同種類測試燒瓶的最小數(shù)量見表2.

表2 生物降解性試驗(yàn)所需燒瓶數(shù)量及分配Tab.2 Number and distribution of flask required in biodegradability tests

T-9菌株活化后進(jìn)行廢棄蓖麻基潤滑油的生物降解試驗(yàn)，從種子培養(yǎng)基中吸取1 mL種子液，接入到1.5.2中需要添加菌液的錐形瓶中，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d.

1.5.4 破乳和破細(xì)胞壁實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)期結(jié)束后，在各錐形瓶中加入約1 mL 1 mol/L HCl和20 g NaCl，搖瓶振蕩，待 NaCl完全溶解后，采用超聲波細(xì)胞破碎儀將培養(yǎng)基中的微生物細(xì)胞壁破碎，使內(nèi)容物釋放及進(jìn)一步破乳.間歇式超聲波破碎條件:200 W，2 min，工作2 s，停止1 s，破碎后待三角瓶內(nèi)溶液溫度冷卻至室溫后再進(jìn)行分離萃取.

1.5.5 萃取

培養(yǎng)液10 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞，取上清液，將各樣品倒入250 mL分液漏斗中，分3次加入四氯化碳進(jìn)行萃取，每次加入30 mL，劇烈搖動1～2 min，經(jīng)常開啟活塞排氣;靜置至分層后，開啟漏斗下部活塞，將下層有機(jī)相收入裝有無水硫酸鈉的帶玻璃容量瓶密閉振蕩，或在25 mL帶玻塞容量瓶中操作，靜置去水24 h后，置入10 mm光路長的IR室，測量CH3-CH2-的C—H紅外伸縮振動吸收峰(在2 930±10 cm－1)的峰高.

1.5.6 IR分析及生物降解率計(jì)算

用紅外光譜分析儀測定萃取液，波數(shù)范圍2 500～3 500 cm－1，用裝樣的石英比色皿進(jìn)行掃描，對2 930±10 cm－1處吸收峰的吸光度進(jìn)行定量處理，測定各毒化瓶和測試瓶(E燒瓶)萃取液的IR吸收，根據(jù)式(1)計(jì)算殘余油含量.

式(1)中XE為“0 d”瓶IR吸收的平均值.

生物降解率按式(2)計(jì)算.

式(2)中，P為毒化瓶中殘余油含量(平均值)，%;T為測試瓶中殘余油含量(平均值)，%.

采用紅外光譜鑒定四氯化碳中C—H含量，用四氯化碳做空白，確保萃取劑中無干擾.

1.6 降解產(chǎn)物分析

取廢棄蓖麻基潤滑油降解后的培養(yǎng)液，10 000 r/min離心10 min，沉淀去細(xì)胞，取離心上清液，加入濃硫酸，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，70℃水浴加熱30 min進(jìn)行甲酯化處理，用正己烷作萃取劑共萃取3次，每次用量30 mL，劇振2 min，靜置分層，收集萃取液上層有機(jī)相，放入三角瓶中，用約10 g無水Mg-SO4除去水分后，進(jìn)行GC/MS分析.GC/MS條件:進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度320℃，分流比20∶1，程序升溫 初始溫度130℃，以8℃/min升到320℃，保留時(shí)間10 min，柱流速1 mL/min，柱型號 VF-5 ht，柱規(guī)格30 m ×0.25 mm，0.10 μm，4 000 MS 型質(zhì)譜儀(Agilent公司)，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 000，離子源EI，質(zhì)量分析器離子阱，傳輸線溫度280℃，離子阱溫度220℃，檢索譜庫NIST 05.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及篩選

從內(nèi)蒙蓖麻榨油廠排污口采取土樣和水樣，分離篩選出10株細(xì)菌，編號T-1至T-10.將分離得到的菌株經(jīng)過誘導(dǎo)馴化后，選取能在廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源培養(yǎng)基上生長較好的菌株T-9作為試驗(yàn)菌株.

2.2 菌株降解條件的特性研究

2.2.1 最適pH值的確定

在其他條件一致的情況下，培養(yǎng)基的初始pH值對菌株T-9的生長具有較大影響，每種細(xì)菌都有最適生長pH值，不處于最適生長pH值，菌株就不能良好地生長繁殖.菌株T-9在pH值為5～10中都能較好生長，如圖1，即在酸、堿性條件下都能適應(yīng)并生長.最適pH值為5.0.

2.2.2 最適生長溫度的選取

溫度影響著微生物體內(nèi)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，它對生物有機(jī)體的影響表現(xiàn)在兩個(gè)方面:一方面，隨著溫度的上升，細(xì)胞中的生物化學(xué)反應(yīng)速率和生長速率加快;另一方面，機(jī)體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸和催化反應(yīng)的酶等對溫度都很敏感，隨著溫度的增高可能受到不同程度的破壞［10］.因此，適宜的溫度對選取的菌種性能至關(guān)重要.培養(yǎng)溫度對菌株T-9生長的影響見圖2.

圖1 初始pH值對菌株T-9生長的影響Fig.1 Effect of initial pH on the growth of T-9 strain

圖2 培養(yǎng)溫度對菌株T-9生長的影響Fig.2 Effect of temperature on the growth of T-9 strain

由圖2可以看出，在不同的培養(yǎng)溫度下，菌株T-9在30℃時(shí)生物量略高，但在15～35℃時(shí)T-9菌株的生物量變化不大，表明T-9菌株有較廣的生長溫度，30℃比較適宜.超過35℃，生物量顯著降低，表明更高溫度不適于其生長.

2.2.3 耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在微生物的實(shí)地修復(fù)環(huán)境中，土壤的鹽堿性對菌株生長有一定影響.將T-9菌株以相同接種量接入NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，3%，5%，7%，9%的富集培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)3 d，測定OD600值，結(jié)果見圖3.

圖3 菌株耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of salt tolerance test

由圖3可知，菌株T-9在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)生長良好，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)生長受到抑制，但菌株在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% ～5%都能較好生長，說明菌株具有一定的耐鹽性.

2.3 菌落形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果

菌落光滑呈圓形、較大、濕潤，中間隆起，乳白色，邊緣整齊.短桿狀，有鞭毛，運(yùn)動，革蘭氏陰性，能利用葡萄糖、乳糖、木糖、甘露醇、谷氨酸鈉等作為碳源生長，不能利用硝酸鈉作為氮源，但能利用亞鐵氰化鉀為氮源.葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，淀粉水解為陰性等實(shí)驗(yàn)結(jié)果及菌落特征見表3，初步鑒定菌株T-9為假單胞菌屬.

表3 T-9菌株生理生化特征Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of T-9 strain

2.4 廢棄蓖麻基潤滑油降解處理后紅外光譜分析

采用紅外光譜檢測碳-氫組合的最大吸收值表示降解殘余物含量，其檢測結(jié)果較可靠、準(zhǔn)確.實(shí)驗(yàn)過程中，中性瓶因?yàn)椴患尤霛櫥?，?xì)菌缺乏碳源，因而不能生長.中性瓶的作用是扣除因加入菌液所產(chǎn)生的紅外光譜值.毒性瓶加入了潤滑油，雖然沒有接入菌液，仍需要加入HgCl2，目的是為了抑制雜菌對潤滑油可能發(fā)生的降解.

在降解率的計(jì)算方法上，本試驗(yàn)同樣消除了培養(yǎng)瓶由于加入菌液而引起的實(shí)驗(yàn)誤差，較CECL-33-A-93方法簡單、快捷，比目前國內(nèi)常用方法邏輯更加嚴(yán)密，精確度更高［11］.

菌株T-9培養(yǎng)7 d后經(jīng)過前期處理萃取后進(jìn)行紅外檢測，結(jié)果如圖4.

圖4 菌株T-9 FT-IR檢測譜圖Fig.4 FT-IR spectra of T-9 strain

由圖4可知，4組瓶實(shí)驗(yàn)中，在2 930 cm－1處都有特征吸收峰，從上到下依次是毒化瓶，0 d測試瓶，7 d測試瓶和中性瓶.根據(jù)特征峰在2 930 cm－1處通過J法積分后得出各組瓶的J值，再根據(jù)式(1)、(2)計(jì)算余油含量和生物降解率.通過計(jì)算得出菌株T-9的降解率為72%.

2.5 廢棄蓖麻基潤滑油降解產(chǎn)物的GC/MS分析

廢棄蓖麻基潤滑油降解產(chǎn)物的GC/MS分析結(jié)果如圖5.

圖5 廢棄蓖麻基潤滑油降解氣相色譜分析Fig.5 Degradation of waste castor oil-based analized by gas chromatography

從圖5可以看出，(a)、(b)兩圖均只出現(xiàn)了一個(gè)峰，但(b)圖的峰高大大降低.根據(jù)峰面積計(jì)算得出，廢棄蓖麻基潤滑油降解率為80%左右.

3 結(jié)論

從蓖麻榨油廠排污口廢水中分離篩選出一株高效降解廢棄蓖麻基潤滑油的菌株T-9，在潤滑油質(zhì)量濃度為10 g/L，初始pH值為5.0，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，30℃下培養(yǎng)7 d后，采用改進(jìn)的CEC-L-33-A-93方法測得其對廢棄蓖麻基潤滑油的降解率為72%.采用GC/MS對降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，測得其對廢棄蓖麻基潤滑油降解率為80%.經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)，初步鑒定為假單胞菌屬.

T-9菌株是從自然界中通過馴化分離得到，對其進(jìn)行廢棄蓖麻基潤滑油降解實(shí)驗(yàn)，并用GC/MS檢測降解后的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)蓖麻基潤滑油的基礎(chǔ)油的降解比較徹底，沒有發(fā)現(xiàn)其他中間代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步的機(jī)理研究還需要探討.其中，初始pH值、培養(yǎng)溫度、營養(yǎng)條件等都對微生物的代謝產(chǎn)物有影響，其主要作用在于:引起細(xì)胞膜電荷的變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響代謝過程中酶的活性.另一方面，溫度是影響微生物各種特性的重要因素，溫度升高，細(xì)胞中的生物化學(xué)反應(yīng)速率和生長速率加快，機(jī)體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸和催化反應(yīng)的酶等可能會受到不同程度的破壞.

蓖麻基潤滑油作為一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)混合體系，其降解途徑因各物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和降解微生物的不同而不同，蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油的降解性能，決定了它的生物降解性.因此，綠色蓖麻基潤滑油很有希望成為無二次污染的再生能源.

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(責(zé)任編輯:葉紅波)

Isolation of Castor Oil-based Waste Degrading Bacteria and Its Degradation Characteristics

LIU Ya-qiong1，WANG Chang-lu1，HE Dong1，ZHANG Li-hong1，CHEN Mian-hua1，WANG Yu-rong1，HE Liang-nian2，YE Feng2
(1.School of Food Engineering and Biotechnology/Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;2.Engineering Research Center for Castor，Nankai University，Tianjin 300071，China)

Ten strains which can degrade the waste lubricants were isolated from sewage samples of the outfall of a castor oil extraction plant in Inner Mongolia，China，and T-9 strain showed the strongest lubricant degradation ability.The optimal degradation condition of T-9 strain was pH 5.0，and temperature 30℃.T-9 strain could grow well in the medium containing 1% ～5%NaCl.T-9 strain was identified as Pseudomonas by the colony morphology，physiological and biochemical characteristics.By improved CEC-L-33-A-93 method，the degradation rate of castor oil-based waste lubricants was 72%when incubated for 7 days under the conditions as following:10 g/L oil，initial pH 5.0，rotation speed of 180 r/min，and 30℃.By GC/MS analysis of degradation products，degradation rate was 80%，indicating that the T-9 strain had good castor-based oil degradation ability.

castor based lubricants;CEC-L-33-A-93;GC/MS;degradation characteristics

TQ64;TS225.1

A

1671-1513(2011)06-0015-05

2011-07-14

劉亞瓊，女，碩士研究生，研究方向?yàn)閺U棄蓖麻基潤滑油的生物降解;

王昌祿，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究.通訊作者.