鄧?guó)P玲

(武漢市漢口醫(yī)院藥劑科，430012)

三葉委陵菜(Protentilla Freyniana Bornm)為多年生草本植物，其根莖或全草入藥，味苦澀，具清熱、解毒、涼血、鎮(zhèn)痛之功效，可用于治療骨結(jié)核、口腔炎、跌打損傷、外傷出血等［1-2］。三葉委陵菜中含有多種甾體化合物，其中β-谷甾醇(β-sitosterol)為主要活性成分之一［3-4］。筆者采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì) β-谷甾醇進(jìn)行測(cè)定，方法簡(jiǎn)便，分離結(jié)果令人滿意，重復(fù)性好，可為三葉委陵菜的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent高效液相色譜儀(單元泵，手動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，柱溫箱，變色龍工作站)，β-谷甾醇(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110851-200708)，三葉委陵菜根莖于2009年7月采自江西省廬山，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥系陳家春教授鑒定，粉碎成粒徑0.250～0.425 mm(40～60目)粉末，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(96∶4)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速1.2 mL·min-1，進(jìn)樣量:20μL，柱溫:30℃。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取β-谷甾醇對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成每毫升含β-谷甾醇10μg的溶液，經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在206 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但流動(dòng)相在此有末端吸收，不適宜做檢測(cè)波長(zhǎng)，因210 nm離最大吸收處最近，避開流動(dòng)相末端吸收，故以210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取β-谷甾醇對(duì)照品10.12 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4 樣品溶液的制備 取三葉委陵菜根莖粉末樣品約1.0 g，精密稱定，精密量取并加入甲醇10 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲處理15 min，放置至室溫，加甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，過濾，續(xù)濾液為供試品溶液。

2.5 方法專屬性 分別吸取β-谷甾醇對(duì)照品儲(chǔ)備溶液、供試品溶液各20μL，進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，可見β-谷甾醇對(duì)照品、供試品約在13 min出現(xiàn)β-谷甾醇特征吸收峰，可達(dá)到基線分離。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取β-谷甾醇儲(chǔ)備液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，以流動(dòng)相定容至10 mL，搖勻，得到濃度分別為 40.48，80.96，121.44，161.92，202.40μg·mL-1的β-谷甾醇對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.048 7X-0.512 7，r=0.999 8，β-谷甾醇線性范圍為 40.48 ～202.40 μg·mL-1。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液在0，1，2，4，8，12 h分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果基本一致，其RSD為1.45%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取濃度為121.44μg·mL-1的對(duì)照品溶液20μL，在上述相同色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的RSD為1.27%。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，精密稱定，制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定β-谷甾醇含量，平均含量0.18%，RSD為1.24%。

2.10 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的粉末樣品(批號(hào):090712)約0.5 g，精密加入適量的β-谷甾醇對(duì)照品，按供試品溶液的制備法制備樣品溶液9份。依次進(jìn)樣，平均回收率為98.11%，RSD為1.36%。見表1。

表1 β-谷甾醇加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品測(cè)定 分別精密稱取3批樣品，按上述樣品溶液的制備法制備樣品溶液，依上述方法操作，記錄色譜峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其含量。結(jié)果見表2。

表2 3批樣品中β-谷甾醇含量測(cè)定結(jié)果 n=3

3 討論

筆者在本研究建立的高效液相色譜法對(duì)三葉委陵菜有效成分β-谷甾醇的含量測(cè)定有較好的精密度和準(zhǔn)確度。β-谷甾醇無紫外吸收，采用低波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，無需衍生化，結(jié)果令人滿意［5］。

通過以上結(jié)果可以看出，三葉委陵菜中β-谷甾醇的含量超過千分之一，本方法靈敏、準(zhǔn)確，可以為三葉委陵菜質(zhì)量控制提供參考。

［1］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊(cè))［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977:69-70.

［2］ 劉梁，韓定獻(xiàn)，周軍，等.三葉委陵菜根中三萜類化合物抗病毒作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(8):1484-1485.

［3］ 蔡玉華，劉梁，韓丁獻(xiàn)，等.三葉委陵菜根化學(xué)成分的研究［J］.武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(9):32-33.

［4］ 劉新國(guó)，魏元鋒，韓建偉，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選三葉委陵菜滲漉提取的工藝條件［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，26(6):652-654.

［5］ 吳家紅，徐文芬，文雯，等.HPLC法測(cè)定秋海棠屬藥材中β-谷甾醇的含量［J］. 微量元素與健康研究，2009，26(6):24-26.