李 超,潘榮清,唐超西,閆 新,李順鵬 (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點開放實驗室,江蘇 南京 210095)

噻嗪酮降解菌BF3的分離、鑒定及降解特性

李 超,潘榮清,唐超西,閆 新*,李順鵬 (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點開放實驗室,江蘇 南京 210095)

分離到1株能降解噻嗪酮的細菌BF3,通過生理生化試驗和16S rRNA基因同源性序列分析,初步鑒定其屬于副球菌屬(Paracoccus sp.).該菌在接種量為 2%的條件下,7d內(nèi)對 50mg/L噻嗪酮的降解率為 68.2%.其最適降解 pH值為 7.0,降解最適溫度為 30℃.BF3對低濃度

(1,10,30,50mg/L)的噻嗪酮有較好的降解效果,但對高濃度(100,200mg/L)的噻嗪酮降解效果一般,降解速率與起始接種量呈正相關(guān).需氧量試驗表明,BF3在通氣良好的狀況下降解速率較高.

噻嗪酮；副球菌屬；降解特性

噻嗪酮,又稱稻虱靈、優(yōu)樂得,化學(xué)名稱為2-叔-丁亞氨基-3-異丙基-5-苯基-3,4,5,6-四氫-2H-1,3,5-噻二嗪-4-酮,對酸、堿、光、熱穩(wěn)定[1].噻嗪酮是一種抑制昆蟲生長發(fā)育的選擇性殺蟲劑[2],觸殺作用較強,有胃毒作用,其作用機制為抑制昆蟲幾丁質(zhì)的合成和干擾新陳代謝,從而致使昆蟲蛻皮畸形或翅畸形而緩慢死亡[3-5].長期以來,人們普遍認為噻嗪酮在殺死目標害蟲的同時,因不傷害益蟲而具有很好的防治功效,使其在綜合蟲害管理方案(IPM)中應(yīng)用廣泛[6-8].然而,近年來的研究證明,殘留的噻嗪酮對一些有益昆蟲或幼蟲有負面影響,如 Smith[9]研究結(jié)果表明,殘留的噻嗪酮導(dǎo)致了大量幼蟲的死亡以及減少了瓢蟲進行規(guī)模飼養(yǎng)時的產(chǎn)卵量;此外,其他研究也證明了噻嗪酮的殘留影響若干種瓢蟲和半翅類昆蟲的產(chǎn)卵量和孵化[6,9-11].

在中國,噻嗪酮主要用于水稻、茶樹、柑橘、蔬菜等農(nóng)作物的病蟲害防治[12],據(jù)中國 24種出口日本的蔬菜農(nóng)殘超標研究顯示,扁豆和小松菜中噻嗪酮殘留量嚴重超標[13],這不僅影響了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量,同時還對人們的健康造成影響.因此,如何消除潛在的噻嗪酮殘留問題已迫在眉睫.微生物具有繁殖迅速、變異快和代謝途徑多樣等特點,釋放到環(huán)境中的農(nóng)藥等異生物大部分被微生物分解,微生物修復(fù)被認為是污染物修復(fù)的有效手段[14-21].目前還沒有關(guān)于噻嗪酮微生物降解的報道,本研究從長期施用噻嗪酮的稻田地中分離到1株能夠降解噻嗪酮的細菌,對該菌的分類地位及降解特性進行了研究,以期為噻嗪酮的微生物降解提供理論依據(jù),同時為噻嗪酮污染的生物修復(fù)打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MSM,g/L): NaCl 1.00, NH4NO31.00,K2HPO41.50,KH2PO40.50, MgSO4· 7H2O 0.10.pH值7.0.

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母膏 5.00,蛋白胨 10.00, NaCl 5.00(固體加1.5%的瓊脂).pH值7.0.

初始降解培養(yǎng)基(g/L):基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MSM),葡萄糖0.50,蛋白胨0.50.

1.2 菌株的分離篩選

取長期施用噻嗪酮的稻田地土壤 5.00g,置于100mL噻嗪酮濃度為50mg/L初始降解培養(yǎng)基中,于30℃、180r/min搖床富集7d,然后每7d以5%的接種量轉(zhuǎn)接到相同的培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)接 3次.然后取0.5mL富集液梯度稀釋,取10-5～10-8稀釋度的液體各0.1mL,涂布于加有50mg/L噻嗪酮的初始降解培養(yǎng)基固體平板上,30℃培養(yǎng)3～4d后,挑取單菌落接種于含 50mg/L噻嗪酮的初始降解培養(yǎng)基中,30℃、180r/min搖床培養(yǎng)7d,檢測其降解效果[22].

1.3 菌株的鑒定

菌株形態(tài)及生理生化特性測定參照文獻[23]進行.菌株16S rRNA基因的克隆及序列測定和比較參照文獻[24-25],提BF3基因組DNA作為模板,進行 16S rRNA基因的擴增.正向引物: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’;25μL體系為:模板1μL, dNTP(25 mmol/L)2μL,引物(1 mmol/L)各 1μL,10×Taq緩沖液 2.5μL,Mg2+(25 mmol/L)1.5μL,Taq 酶 (5U/μL)0.3μL,超 純 水15.7μL.聚合酶鏈式反應(yīng)條件:95℃,5min;94℃, 0.5min; 52℃,1min; 72℃,1min;循環(huán)30次,72℃延伸10min.采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收擴增片段,瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的大小后(1.5kb左右),將其TA克隆并測序,將測序結(jié)果通過(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)及(http://rdp.cme. msu.edu)上的相關(guān)16S rRNA基因序列進行同源性比對分析.

1.4 噻嗪酮提取和檢測

樣品提取參考文獻[26]進行:采用等量萃取法,加入等體積的二氯甲烷進行萃取,用高速旋渦振蕩器混合 5min,靜置后吸取下層有機相 1mL至1.5mL離心管中,氮氣吹至干后,加入0.5mL乙腈溶解樣品,待測.

液相色譜分析條件[27]:Waters C18反相柱;流動相:乙腈: 0.1% H3PO4水溶液(體積比為60:40),流速 0.6mL/min;檢測波長:245nm;柱溫:40℃;進樣量20μL.

1.5 菌株培養(yǎng)

從平板上挑取一單菌落,接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中,于 30℃,200r/min搖床培養(yǎng) 24～36h后,將菌液離心,用無菌水洗滌2次,再加入無菌水,測定至光密度A600nm≈2.00,用為種子液[28].

1.6 菌體生長量的測定

噻嗪酮在無機鹽液體培養(yǎng)基中的溶解度很小,會形成白色沉淀,干擾菌體A600nm值的測定,因此本研究采用稀釋涂布法來測量菌株的生長量.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及其生理生化特性

分離、篩選獲得了1株不能利用噻嗪酮為唯一碳源生長的菌株,命名為BF3,該菌株屬于革蘭氏陰性菌,短桿狀.菌落邊緣齊整,乳白偏黃色;菌落隆起,呈圓形,不透明,表面光滑.V.P反應(yīng)陰性,甲基紅實驗陰性.

2.2 菌株16S rRNA 基因的序列分析

以菌株BF3的基因組DNA為模板,利用細菌 16S rRNA 基因通用引物進行 PCR 擴增,得到長度約為 1.5kb的擴增產(chǎn)物.測序后在GenBank上登錄,序列號為FJ593184.根據(jù)相似性比對,菌株 BF3分別與 Paracoccus versutus和Paracoccus bengalensis相似性均為100%.目前,細菌分類學(xué)家的共識是認為當(dāng)某2個細菌的16S rRNA的相似性大于 95%時,可將其歸為同一屬

[29].因此,根據(jù)上述相似性比較結(jié)果,再結(jié)合菌株的生理生化特性將其初步鑒定為副球菌屬(Paracoccus sp. ).

2.3 降解培養(yǎng)基的優(yōu)化

圖1 碳源對BF3生長與其對噻嗪酮降解的影響Fig.1 Effect of carbon source on growth and degradation of BF3

圖2 氮源對BF3生長與其降解噻嗪酮的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on growth and degradation of BF3

分別以可溶性淀粉、牛肉膏、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、檸檬酸鈉代替初始降解培養(yǎng)基中的碳源,質(zhì)量濃度為 0.50g/L.在噻嗪酮濃度為50mg/L的條件下接入 2%種子液,于 30℃、180r/min條件下培養(yǎng)24h后用吸光度法測定菌濃度,并用液相檢測噻嗪酮的濃度,計算降解率,繪圖(圖1).再分別以蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母膏、脲素代替初始降解培養(yǎng)基中的氮源,質(zhì)量濃度為0.50g/L.方法同上(圖2).不同碳、氮源對菌株BF3生長與降解的影響見圖1和圖2.由圖1可見,在使用牛肉膏為碳源時,A600nm值最大,即菌濃度最高,同時降解率最高,所以選用牛肉膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳碳源.由圖2可知,菌株BF3以蛋白胨為氮源時菌濃度最高,且降解效果最好,因此試驗選用蛋白胨作為培養(yǎng)基中的最佳氮源.最終的降解培養(yǎng)基(g/L):NH4NO31.00, K2HPO41.50, KH2PO40.50, MgSO4·7H2O 0.20, NaCl 0.50,牛肉膏0.50,蛋白胨0.50.pH值7.0.

2.4 菌株生長和噻嗪酮降解的關(guān)系

在噻嗪酮終濃度為 50mg/L降解培養(yǎng)基中,接入2%種子液,于30℃、180r/min搖床培養(yǎng),每隔1d取樣分析培養(yǎng)液中噻嗪酮濃度和菌體的生長量,繪制降解曲線.從圖3中可見,菌株BF3能夠有效地降解噻嗪酮,7d內(nèi)對噻嗪酮的降解率達68.2%.菌體在最初的 1d內(nèi),雖然生長緩慢,但噻嗪酮已被迅速降解;在2～6d內(nèi),菌體迅速生長并達到穩(wěn)定期,這一階段降解速率也逐漸變慢;6d以后細胞進入衰亡期,同時降解率達到最大值,不再變化.推斷可能是在降解后期產(chǎn)生了相關(guān)的代謝產(chǎn)物,反饋抑制了BF3對噻嗪酮的降解.

圖3 BF3的生長與噻嗪酮降解率的關(guān)系曲線Fig.3 The relationship between the growth of BF3 and its ability to remove buprofezin

2.5 初始濃度對BF3降解噻嗪酮的影響

在降解培養(yǎng)基中加入噻嗪酮使其終濃度分別為 1,10,30,50,100,200mg/L.接入 2%種子液,于30℃、180r/min搖床培養(yǎng),每隔1d取樣一次,測定噻嗪酮的殘留量.從圖4的結(jié)果可見,BF3對低濃度(1,10,30,50mg/L)的噻嗪酮有較好的降解效果,對高濃度(100,200mg/L)的噻嗪酮降解效果一般.BF3可以將1mg/L和10mg/L的噻嗪酮在7天內(nèi)完全降解,但隨著噻嗪酮初始濃度的增加,降解率逐漸降低,這是由于在相同條件下,高濃度的噻嗪酮經(jīng)降解產(chǎn)生了比低濃度噻嗪酮更多的相關(guān)代謝產(chǎn)物,更早的產(chǎn)生反饋抑制作用,因此降解率下降.

圖4 噻嗪酮初始濃度對BF3降解噻嗪酮的影響Fig.4 Effect of initial buprofezin concentration on its degradation by strain BF3

2.6 溫度對BF3降解噻嗪酮的影響

在噻嗪酮終濃度為 50mg/L降解培養(yǎng)基中,接入2%種子液,分別在15,20,25,30,37℃溫度下,于180r/min搖床培養(yǎng),每隔1d取樣一次,測定噻嗪酮的殘留量.由圖5可知,溫度對噻嗪酮降解影響較顯著.BF3在30℃條件下、7d內(nèi)能將噻嗪酮降解68.2%;在15,20,25,37℃條件下,7d內(nèi)的降解率分別為19.5%、39.5%、50.0%、47.1%.該數(shù)據(jù)表明,不同的溫度下BF3對農(nóng)藥的降解效果相差較大,但在30℃時,降解效果最好.

圖5 溫度對BF3噻嗪酮降解的影響Fig.5 Effect of temperature on buprofezin degradation by strain BF3

2.7 pH值對BF3降解噻嗪酮的影響

在噻嗪酮終濃度為 50mg/L降解培養(yǎng)基中,接入2%種子液,設(shè)定pH值為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0, 10.0,于30℃、180r/min搖床培養(yǎng),每隔1d取樣一次,測定噻嗪酮的殘留量.由圖6可知,當(dāng)pH值為7.0時,BF3對噻嗪酮的降解率最高;當(dāng)pH＞7.0時,其降解率隨著 pH值的升高呈明顯的下降趨勢;當(dāng)pH值為10.0時,噻嗪酮的降解率僅為10.2%.此外,在酸性的環(huán)境條件下,噻嗪酮的降解率也有所下降,當(dāng)pH5.0時,噻嗪酮的降解率為38.0%.這可能是由于過酸過堿條件都不利于BF3的生長.

圖6 pH值對BF3降解噻嗪酮的影響Fig.6 Effect of pH value on buprofezin degradation by strain BF3

2.8 接種量對BF3降解噻嗪酮的影響

圖7 接種量對BF3降解噻嗪酮的影響Fig.7 Effect of inoculation on buprofezin degradation by strain BF3

在噻嗪酮終濃度為 50mg/L降解培養(yǎng)基中,以1%,2%,5%,10%,15%的接種量接入2%種子液,于30℃、180r/min搖床培養(yǎng),每隔1d取樣一次,測定噻嗪酮的殘留量.由圖7可知,隨著接種量的增大,噻嗪酮的降解速率逐漸加快,且和起始接種量呈正相關(guān).這是因為接種量越大,菌體就會產(chǎn)生更多相關(guān)的降解酶,從而加快了降解速率,但與此同時,由于存在反饋抑制作用,當(dāng)代謝產(chǎn)物達到一定數(shù)量時降解被抑制,最終降解率達到穩(wěn)定值.

2.9 通氣量對菌株BF3降解噻嗪酮的影響

在 250mL三角瓶中分別加入 30,70,120, 150mL降解培養(yǎng)基,pH值為7.0,加入噻嗪酮使其濃度為 50mg/L,再接入 2%種子液,在 30℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng),每隔1d取樣一次并測定噻嗪酮的殘留量.由圖8可知,在培養(yǎng)7d后,裝液量為30mL時噻嗪酮的降解率最高,為68.2%;裝液量為150mL的降解率最低,為45.0%.裝液量為70mL和120ml的差別不大,降解率均在60%左右.在通氣量較好,即裝液量較少時,BF3降解噻嗪酮的速率比在通氣量較低時稍高,但差異不是很顯著.推斷可能是在通氣量較低時,三角瓶內(nèi)空間相對較小,對菌體的供氧不足,抑制了菌體的生長,而導(dǎo)致了降解速率的下降.

圖8 通氣量對BF3降解噻嗪酮的影響Fig.8 Effect of ventilation on buprofezin degradation by strain BF3

3 結(jié)論

3.1 分離到一株噻嗪酮降解菌,經(jīng)生理生化實驗及16S rRNA基因序列比對,確定該菌為副球菌(Paracoccus sp.),命名為BF3.

3.2 BF3不能利用噻嗪酮為唯一碳源,需加入外源碳源.其降解噻嗪酮的最適pH值為7.0,最適溫度為 30℃,在接種量為 2%時對噻嗪酮的降解效果較好,降解噻嗪酮的速率和起始接種量呈正相關(guān),降解速率隨著通氣量的提高而加快.BF3對低濃度(1,10,30,50mg/L)的噻嗪酮有較好的降解效果,但對高濃度(100,200mg/L)的噻嗪酮降解效果一般.

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Isolation, identification and characterization of a buprofezin-degrading bacterium BF3.

LI Chao, PAN Rong-qing, TANG Chao-xi, YAN Xin*, LI Shun-peng(Key Laboratory of Microbiological Engineering Agricultural Environment, Ministry of Agriculture, College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). China Environmental Science, 2011,31(6)：965～970

A buprofezin-degrading bacterium BF3 was isolated for the first time in this work. Through biochemicalphysiological identification and the analysis of its 16S rRNA gene sequence, BF3 was identified preliminarily as Paracoccus sp.. BF3 could degrade 68.2% of 50mg/L buprofezin in 7 days. The most adaptable pH and temperature for the degradation were 7.0 and 30℃, respectively. BF3 had a better degradation effect at low concentrations (1,10,30,50mg/L) of buprofezin and the degradation rate was related positively to initial inoculation amount. The oxygen consumption experiment showed that the buprofezin degradation rate of good ventilation state was higher than that at relatively poor ventilation state.

buprofezin；Paracoccus sp；degradation

X172

A

1000-6923(2011)06-0965-06

2010-10-02

江蘇省科技支撐計劃(BE2009670)

* 責(zé)任作者, 講師, yanxin@njau.edu.cn

李 超(1986-),男,安徽無為人,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生,主要從事農(nóng)藥降解菌的分離及土壤的生物修復(fù)研究.