華玉妹,陳英旭,張少輝 (.浙江大學(xué)環(huán)境工程系,浙江 杭州 0029;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,湖北武漢 40070;.武漢理工大學(xué)土木與建筑學(xué)院,湖北 武漢 40070)
污泥生物瀝濾中硫細(xì)菌變化和胞外多聚物作用的研究
華玉妹1,2*,陳英旭1,張少輝3(1.浙江大學(xué)環(huán)境工程系,浙江 杭州 310029;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,湖北武漢 430070;3.武漢理工大學(xué)土木與建筑學(xué)院,湖北 武漢 430070)
通過序批試驗(yàn),分析污泥生物瀝濾過程中 pH值、異養(yǎng)菌數(shù)量變化以及硫細(xì)菌的形態(tài),探討了污泥中重金屬在胞外多聚物(EPS)中的分布變化.結(jié)果表明,污泥經(jīng)生物瀝濾后異養(yǎng)菌大量死亡.掃描電鏡和透射電鏡對(duì)污泥微生物形態(tài)的觀測發(fā)現(xiàn),隨著生物瀝濾時(shí)間的延長,生物瀝濾污泥明顯比對(duì)照污泥中的微生物分布緊密,而且桿狀和短桿狀菌呈現(xiàn)逐漸增多趨勢.生物瀝濾后期出現(xiàn)受損的細(xì)菌胞體以及釋放了細(xì)胞物質(zhì)的細(xì)菌空殼.污泥瀝濾液中EPS含量有所增加,瀝濾過程中EPS的松散結(jié)合態(tài)與緊密結(jié)合態(tài)的比值呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,可反映瀝濾前期細(xì)菌處于加速生長期的居多,而后期處于減速生長期的細(xì)菌逐漸增多.污泥 EPS中重金屬含量在生物瀝濾幾天后表現(xiàn)持續(xù)增長,Cu、Pb和Zn分布于EPS中的最高含量分別占污泥中總量的14.7%、20.3%和24.2%.延長酸化時(shí)間,EPS可被水解,而導(dǎo)致其中重金屬含量呈現(xiàn)一定下降趨勢.
污泥;生物瀝濾;硫細(xì)菌;胞外多聚物;重金屬
污水處理過程產(chǎn)生的大量重金屬富集在污泥中[1],限制了污泥資源化利用.污泥生物瀝濾是一種運(yùn)用產(chǎn)酸細(xì)菌作用將污泥重金屬溶出去除的無害化技術(shù)[2].目前對(duì)于污泥生物瀝濾的研究集中在底物類型(FeSO4,FeS2和單質(zhì)硫)等影響因素[3-5]、生物瀝濾的污泥除臭、脫水和消化效果
[6-7]以及污泥肥效變化等方面[7-8],多側(cè)重于工藝應(yīng)用的研究.污泥生物瀝濾過程類似于好氧消化,原有微生物會(huì)出現(xiàn)一定程度死亡.但不同于好氧消化的是,生物瀝濾還伴隨著硫細(xì)菌的增殖過程,探討生物瀝濾過程中優(yōu)勢硫細(xì)菌的變化,對(duì)于更好地指導(dǎo)其應(yīng)用具有重要意義.
微生物產(chǎn)生的胞外多聚物(EPS)在污泥對(duì)重金屬的富集過程中起著重要作用,大部分金屬離子通過物理化學(xué)作用被吸附在EPS的結(jié)合點(diǎn)位上,與污泥一同沉降[9-11].重金屬離子與EPS的絡(luò)合較為穩(wěn)定.明確EPS在污泥生物瀝濾過程中的作用狀況,有助于更好地理解生物瀝濾對(duì)重金屬的內(nèi)在作用過程.
本研究分析了污泥生物瀝濾中pH值、異養(yǎng)菌數(shù)量變化以及硫細(xì)菌的形態(tài),探討了污泥生物瀝濾過程中重金屬在EPS中的分布變化.
污泥取自杭州市四堡污水處理廠,該廠同時(shí)接納杭州市部分城區(qū)的生活污水和工業(yè)廢水.該廠初沉池和二沉池的污泥均進(jìn)入污泥濃縮池,之后再進(jìn)入?yún)捬跸?采樣時(shí)從厭氧消化池前的污泥入口處采集,即為初沉池和二沉池的混和生污泥.污泥初始性質(zhì):pH 6.8, Cu、Zn和Pb含量(以干污泥計(jì))分別為296.4,351.3,3756.2mg/kg.
試驗(yàn)采用混合硫細(xì)菌接種液的接種量為2%,單質(zhì)硫粉的投加濃度為3g/L,混合硫細(xì)菌接種液的培養(yǎng)方法[12].取200mL污泥于500mL錐形瓶中,在(28±1)℃振蕩搖床上運(yùn)行,轉(zhuǎn)速為 120r/min.每一樣品做3個(gè)平行樣.每天通過稱重,以蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)損失的水分.取樣后,將污泥樣品在10000r/min下離心 10min,經(jīng)中速定量濾紙過濾后,進(jìn)行各項(xiàng)目分析測定.
嗜酸和弱嗜酸硫細(xì)菌的培養(yǎng)采用瓊脂培養(yǎng)基[13-14].A液為基礎(chǔ)鹽, B液為能源物,C液為培養(yǎng)基的固化劑.
A液:(NH4)2SO42g, KCl 0.1g, K2HPO40.25g, MgSO4·7H2O 0.25g,Ca(NO3)2·4H2O 0.01g,溶于500mL蒸餾水中;B液:將22.1g Na2S2O3·5H2O溶于300mL蒸餾水中; C液:將30g瓊脂粉溶于加200mL蒸餾水中.
A、B和C液分開濕熱滅菌,冷卻至80℃后,三者混合后,按體積均分,各500mL.將兩者用1:5的H2SO4或20%的NaOH分別調(diào)pH值為4.0和7.0,迅速倒平板.pH4.0的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)嗜酸硫細(xì)菌, pH7.0的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)弱嗜酸硫細(xì)菌.取1mL生物瀝濾污泥于10mL具塞試管中與9mL滅菌的磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L, pH7.2)迅速混合均勻,試管中放入5顆直徑3~5mm的玻璃珠,然后,按此法依次稀釋到10-8倍,取10-4~10-8倍數(shù)的污泥樣品各0.1mL進(jìn)行涂布,培養(yǎng)均采用3個(gè)平行,28℃培養(yǎng)2周.
異養(yǎng)菌培養(yǎng)采用肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[15].
采用物理方法分離EPS[16-17],步驟如下:采用3個(gè)平行樣,各取25mL污泥混合液置于30mL的離心試管內(nèi),在6000r/min離心5min,傾出上清液.將污泥顆粒懸浮于 15mL生理鹽水中,并放入玻璃珠若干,在超聲儀中超聲2min,于搖床150r/min下水平振搖 10min,再超聲 2min,而后在8000r/min離心 10min,上清液即為松散結(jié)合態(tài)(LB),取之測其質(zhì)量.LB分離后的污泥顆粒采用熱提取法提取緊密結(jié)合態(tài)(TB),顆粒重新懸浮于25mL生理鹽水中,超聲 3min,80℃水浴加熱30min,12000r/min離心20min,上清液即為TB,取之測其質(zhì)量.EPS質(zhì)量為LB與TB質(zhì)量之和.
提取的LB和TB,經(jīng)105℃烘干,在550℃馬弗爐焙燒4h,然后用30%HNO3加熱溶解,測其重金屬含量[18].
污泥pH值采用pHS-3C型酸度計(jì)測定.
Cu、Pb和Zn濃度采用Perkin Elmer AA100型原子吸收分光光度計(jì)測定.污泥重金屬總量采用HF-HClO4法消解后,用HCl和熱水溶解,原子吸收分光光度法測定.
采用 Philip XL30 ESEM 型掃描電鏡、JEM-1200EX型透射電鏡觀察污泥樣品的微生物形態(tài).將瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的典型菌落用接種環(huán)挑出于去離子水中,輕輕晃動(dòng)使菌落散開,然后將圓形銅片浸入吸附部分細(xì)菌,稍晾干,即可進(jìn)行透射電鏡觀察嗜酸和弱嗜酸硫細(xì)菌.
pH值的變化見圖1.pH值在第2d先有所上升,隨后出現(xiàn)快速下降,第5d后降至2以下,最后穩(wěn)定在1.5左右.當(dāng)pH值降到1.5以后,則對(duì)硫細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用,酸化過程終止.空白樣在第 2d也出現(xiàn) pH值上升的現(xiàn)象,但一直持續(xù)到第 10d方出現(xiàn)下降,且下降幅度不大,由 7.4降至 5.8,這主要是由于好氧消化導(dǎo)致污泥發(fā)生水解酸化而造成的. pH值是影響硫細(xì)菌生長進(jìn)而影響重金屬瀝濾效率的重要因素.污泥中存在弱嗜酸硫細(xì)菌和嗜酸硫細(xì)菌,二者的比生長速率和之間的數(shù)量比例取決于污泥pH值,反過來又對(duì)污泥pH值起作用.在投加適量硫的污泥中,弱嗜酸硫細(xì)菌在中性 pH值下即可迅速生長,促使 pH值降低. pH4.0左右時(shí)弱嗜酸硫細(xì)菌停止生長,嗜酸硫細(xì)菌開始大量增殖,使污泥pH值進(jìn)一步降到2.0以下,兩類細(xì)菌之間存在一種互生關(guān)系,通過協(xié)同作用共同降低pH值[19-20].
圖1 污泥生物瀝濾過程中pH值的變化Fig.1 Variation of pH during bioleaching
污泥重金屬的生物瀝濾過程中,適宜底物使硫細(xì)菌增殖,而污泥中原有的大多數(shù)異養(yǎng)微生物,由于其不能耐受硫細(xì)菌產(chǎn)酸所形成的極端環(huán)境而逐漸死亡.
由圖2可知,對(duì)照為未加接種液和單質(zhì)硫的污泥,第3d,對(duì)照和生物瀝濾污泥的pH值分別為5.7和3.5,兩者的異養(yǎng)菌數(shù)量都出現(xiàn)下降,但差別不大,到第7d,對(duì)照污泥pH值為5.6,生物瀝污泥pH 值為 1.9,兩者的異養(yǎng)菌數(shù)量分別為7.7×108,2.7×107個(gè)/mL.可見生物瀝濾的酸性環(huán)境能夠?qū)е庐愷B(yǎng)微生物的大量死亡.
圖2 生物瀝濾過程中污泥異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化Fig.2 Variation in heterotrophic microorganism amount during bioleaching
污泥重金屬的生物瀝濾過程中,適宜底物使硫細(xì)菌增殖,而污泥中原有的大多數(shù)異養(yǎng)微生物,由于不能耐受硫細(xì)菌產(chǎn)酸所形成的極端環(huán)境而逐漸死亡.借助于掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)研究生物瀝濾不同階段的污泥樣品,可以了解污泥生物瀝濾過程中微生物種群的形態(tài)變化.
以單質(zhì)硫?yàn)榈孜锏牧蚣?xì)菌,如氧化硫硫桿菌和排硫硫桿菌,絕大多數(shù)為桿狀或短桿狀.從圖 3可以看出,第 3d,生物瀝濾污泥與對(duì)照并沒有顯著差異.而到第 7d,生物瀝濾污泥中菌量有所增加,可以觀察到明顯成簇聚集的桿狀和短桿狀細(xì)菌.這些細(xì)菌長約1~2μm,直徑約0.5μm.到第11d生物瀝濾污泥中明顯看出桿狀菌數(shù)量增多,分布密集,推測其為大量硫細(xì)菌通過EPS吸附在單質(zhì)硫上以獲取底物營養(yǎng),細(xì)菌成簇生長有利于協(xié)同作用以抵抗不良環(huán)境的影響.結(jié)合污泥 pH值的變化(圖1),可以得知,第3d生物瀝濾污泥pH值降至4左右,說明此時(shí)弱嗜酸硫細(xì)菌已經(jīng)開始明顯增殖.污泥pH值在第7d時(shí)為2左右,并進(jìn)一步下降,說明此時(shí)并未達(dá)到硫細(xì)菌增長最高峰,硫細(xì)菌從數(shù)量上仍然將繼續(xù)增加.從總體來看,隨著生物瀝濾的進(jìn)行,優(yōu)勢菌有由橢圓和圓形逐步向短桿狀和桿狀過渡的趨勢.而對(duì)照污泥中不但桿狀菌較少,細(xì)菌總數(shù)也相對(duì)較少,大多分布較為分散,沒有出現(xiàn)桿狀菌增多的趨勢.
圖3 污泥掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM graph of sewage sludge
由圖4的TEM照片可以看出,第11d的生物瀝濾污泥中含有多種桿狀菌或短桿狀菌,不同的桿狀菌形態(tài)存在很大差異,細(xì)胞壁的光滑度也存在很大差異.有的細(xì)菌具有纖毛,體內(nèi)存在若干顆粒,可能是積累的碳?;蛄蛄?圖 4b),但目前尚未分離純化到積累硫粒的硫細(xì)菌[21].同時(shí)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌的空殼以及受損的胞體(圖4a,圖 4b),這可能是污泥中原有異養(yǎng)微生物在酸性條件下發(fā)生細(xì)胞水解形成的,也可能是進(jìn)入衰亡期的硫細(xì)菌.可以結(jié)合下一步弱嗜酸菌和嗜酸菌的TEM進(jìn)行分析.
將生物瀝濾污泥進(jìn)行透射電鏡觀察,圖5為生物瀝濾第3d時(shí)的弱嗜酸硫細(xì)菌,圖5a為處于分裂期的細(xì)胞,圖5b與圖4a中若干細(xì)菌形態(tài)很相似,這說明生物瀝濾后期弱嗜酸硫細(xì)菌出現(xiàn)大量死亡和細(xì)胞水解.圖5c為約十幾個(gè)桿狀菌連生的情況,弱嗜酸硫細(xì)菌結(jié)合成長鏈狀生長,并通過所產(chǎn)生的 EPS相互融合,而將其菌體完全包埋,這有利于抵御其它生物的侵襲以及抵抗不良外界條件.Wilkinson[22]曾以進(jìn)化論的觀點(diǎn)指出, EPS的存在表明它可能具有保護(hù)功能,使細(xì)胞免受外界環(huán)境有害因素的影響,同時(shí)細(xì)胞也可借助EPS的吸附能力從較低濃度生長介質(zhì)中吸收所 需離子.
圖4 第11d的生物瀝濾污泥透射電鏡照片F(xiàn)ig.4 TEM graph of bioleaching sludge on 11th day
圖5 弱嗜酸硫細(xì)菌透射電鏡照片F(xiàn)ig.5 TEM graph of less acidophilic sulfur-oxidizing bacteria
圖6 嗜酸硫細(xì)菌透射電鏡照片F(xiàn)ig.6 TEM graph of acidophilic sulfur-oxidizing bacteria
圖6為生物瀝濾第11d時(shí)的嗜酸硫細(xì)菌透射電鏡圖,可看出,嗜酸硫細(xì)菌形狀和大小與圖 4c若干顏色較深的細(xì)菌形態(tài)較為相似(后者因樣品的切片處理而觀測到部分細(xì)菌的橫切面),圖 6a為多個(gè)短稈狀菌通過EPS結(jié)合在一起.試驗(yàn)中所觀測的嗜酸硫細(xì)菌不生鞭毛,而且也未發(fā)現(xiàn)脫落的鞭毛.說明所生長的嗜酸硫細(xì)菌為不生鞭毛的細(xì)菌,可能為不運(yùn)動(dòng)型.
EPS是指細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下分泌于細(xì)胞體外的高分子有機(jī)物,主要組分是多糖、蛋白質(zhì),另外有少量的腐殖質(zhì)、糖醛酸和核酸[23].由于在菌體外所處的特殊位置及其特定的化學(xué)組成,使其成為影響細(xì)菌表面特性的重要因素.從表1可以看出,EPS質(zhì)量占污泥干重的25.0%~43.3%,與其他研究者的結(jié)果較為一致[24].EPS的一個(gè)主要來源是細(xì)菌生長過程中的代謝產(chǎn)物以及細(xì)胞自溶物,在加速生長期細(xì)菌主要排泄低分子聚合物,與細(xì)胞體結(jié)合不緊密,多屬 LB;而減速生長期和內(nèi)源呼吸期主要排泄高分子聚合物,與細(xì)胞體結(jié)合較緊密,多為TB[25].LB/TB在前8d是處于上升趨勢,而后則出現(xiàn)下降,這說明在最初幾天處于加速生長期的細(xì)菌較多,總體來說是處于加速生長期,而后期處于減速生長期的細(xì)菌逐漸增多.
表1 EPS占污泥干重百分比的變化Table 1 Percentage of EPS with respect to dry sewage sludge during bioleaching
EPS中吸附金屬離子的主要是糖類.Brown等[9]指出,EPS內(nèi)的中性糖和陰離子多糖有著吸附不同金屬離子的結(jié)合點(diǎn)位,不同價(jià)態(tài)或不同電荷的金屬離子可以在不同點(diǎn)位與EPS結(jié)合,如中性糖的羥基、陰離子多聚物的羧基都可能是金屬的結(jié)合位.污泥EPS可分為緊密結(jié)合態(tài)(TB)和松散結(jié)合態(tài)(LB),TB在內(nèi)層,與細(xì)胞表面結(jié)合較緊,相對(duì)穩(wěn)定地附著于細(xì)胞壁外,通常為胞囊多聚物;LB在外層,為無明顯邊緣的粘液層,以膠體或溶解狀態(tài)存在于液相主體中,具有流變特性,可向周圍環(huán)境擴(kuò)散,一般指粘質(zhì)多聚物[16].
圖7為EPS中Cu、Pb和Zn含量在生物瀝濾過程中的變化.瀝濾第2d,重金屬在LB與TB中含量很接近,兩者都較低,從整個(gè)運(yùn)行周期總體來看,Cu在LB中含量高于TB,說明EPS中更多的Cu松散存在于EPS的外層,而Pb和Zn在LB和TB兩部分中分布比例較為接近.
圖7 EPS中Cu, Pb和Zn含量在生物瀝濾過程中的變化Fig.7 Content of Cu, Pb and Zn in EPS during bioleaching
瀝濾初期EPS中Cu含量出現(xiàn)下降,這主要是因?yàn)樽畛鯉滋斓娜跛嵝原h(huán)境中,結(jié)合在污泥微生物EPS中的部分Cu有一定程度溶出.Cu在污泥細(xì)胞內(nèi)含量比較多,這部分金屬不會(huì)很快經(jīng)由EPS而溶出,所以起始階段EPS中Cu含量必然會(huì)下降.Pb在EPS中含量的變化與Cu相似,而Zn卻呈現(xiàn)出與前兩者不同的變化趨勢,其含量基本呈上升狀態(tài),這是由于污泥細(xì)胞所吸收的 Zn含量較低,因此大部分 Zn吸附或結(jié)合在胞外,這部分Zn的溶解對(duì)于pH值的要求低于胞內(nèi)Zn,所以最初4d結(jié)合在污泥微生物外的Zn即能夠快速溶出,溶出過程中經(jīng)由EPS,Zn在EPS中含量即出現(xiàn)大幅度升高.Cu、Pb和Zn在整個(gè)周期分布于EPS中的最高含量分別占其污泥中總量的14.7%、20.3%和24.2%.
污泥EPS中重金屬含量在生物瀝濾幾天后表現(xiàn)持續(xù)增長,原因在于:大量增殖的硫細(xì)菌也能分泌EPS,以便附著于底物單質(zhì)硫上,因而溶液中的部分重金屬可能又被吸附或結(jié)合到硫細(xì)菌的EPS中.隨著酸化環(huán)境的加劇,細(xì)胞水解而釋放出胞內(nèi)物質(zhì),積累在污泥細(xì)胞內(nèi)的重金屬也發(fā)生釋放,由于微生物被EPS所包埋,釋放的重金屬經(jīng)由EPS到達(dá)污泥液相中,EPS主要成分為多糖等高分子有機(jī)物,故一部分重金屬必然與其發(fā)生絡(luò)合等作用而滯留在 EPS中.然而隨著瀝濾的進(jìn)行,因EPS并非生物惰性物質(zhì)[26],酸化條件下仍可以被生物降解,故延長酸化時(shí)間的情況下,EPS可能被水解,從而釋放出結(jié)合在其中的重金屬.試驗(yàn)結(jié)果也證明這一點(diǎn),瀝濾第12d,EPS中Cu和Zn含量均呈現(xiàn)一定的下降趨勢.
3.1 生物瀝濾過程中,硫細(xì)菌生長引起pH值降低,污泥中異養(yǎng)菌逐漸死亡,異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)降低2個(gè)數(shù)量級(jí).SEM和TEM對(duì)生物瀝濾過程中污泥微生物形態(tài)的觀測發(fā)現(xiàn),隨著生物瀝濾時(shí)間的延長,生物瀝濾污泥明顯比對(duì)照污泥中的微生物分布緊密,而且桿狀和短桿狀菌呈現(xiàn)逐漸增多趨勢.生物瀝濾末期出現(xiàn)釋放出細(xì)胞物質(zhì)的細(xì)菌空殼,以及受損的細(xì)菌胞體.
3.2 污泥瀝濾過程中EPS含量有所增加,EPS中LB/TB值呈現(xiàn)先上升后下降,可反映前期細(xì)菌瀝濾加速生長期的居多,而后期處于減速生長期的細(xì)菌逐漸增多.污泥EPS中重金屬含量在瀝濾幾天后表現(xiàn)持續(xù)增長,Cu、Pb和Zn在整個(gè)周期分布于EPS中的最高含量分別占其在污泥中總量的14.7%、20.3%和24.2%,不同金屬在EPS中的含量變化存在差異.延長酸化時(shí)間,EPS可被水解,而導(dǎo)致其中重金屬含量呈現(xiàn)一定下降趨勢.
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Variation in sulfur bacteria and extracellular polymeric substances during sewage sludge bioleaching.
HUA Yu-mei1,2*, CHEN Ying-xu1, ZHANG Shao-hui3(1.Department of Environmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China;2.College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;3.School of Civil Engineering and Architecture, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China) China Environmental Science, 2011,31(5):795~802
Lots of heterotrophic bacteria died after sewage sludge bioleaching. The exploration of microbial communities using scanning electron microscopy and transmission electron microscopy illustrated that the bacteria distribution in bioleaching sludge was more intensive than that in the control sludge, and the rod-shaped and short rod-shaped bacteria appeared to increase with the extension of time. The damaged bacteria cell and residual cell without intracellular matter emerged at the anaphase of bioleaching. The weight percentage of extracellular polymeric substances (EPS) in the sludge leachate increased after bioleaching. The EPS ratio of loosely bound fraction to tightly bound fraction exhibited an upward trend followed with a downward trend, which indicated that large quantities of bacteria were at accelerated growth phase during the prophase of bioleaching while at deceleration growth phase during the anaphase of bioleaching. The content of heavy metals in the EPS showed a continuous increase after several days of run. The highest content percentages of Cu, Pb and Zn in the EPS with respect to the total sludge content were 14.7%、20.3% and 24.2% respectively. EPS could be hydrolyzed under prolonged bioleaching, resulting in a decrease of heavy metals content in EPS.
sewage sludge;bioleaching;sulfur bacteria;extracellular polymeric substances;heavy metals
X703.1
A
1000-6923(2011)05-0795-08
2010-09-10
國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50809030);長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(YRWEF08002)
* 責(zé)任作者, 副教授, ymhua@mail.hzau.edu.cn
華玉妹(1974-),女,山東萊陽人,副教授,博士,主要從事廢物處理處置與資源化、水環(huán)境研究.發(fā)表論文20余篇.