陳道軍,吳 明,詹 鋒,林書典,符克英,韓 輝

(海南省人民醫(yī)院，?？?570311)

IgA腎病(IgAN)是一種多病因引起的以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為主的系膜增生性腎小球腎炎，已成為全球最常見的原發(fā)性腎小球疾病[1]。臨床和病理表現(xiàn)多樣化，個(gè)體預(yù)后差異懸殊，10%～20%的成年患者在10年內(nèi)可進(jìn)展為終末期腎臟病[2]。迄今為止尚無(wú)一種分型能準(zhǔn)確地反映患者的臨床實(shí)際情況，各個(gè)分型之間也很難達(dá)成一致。尋找腎臟病理組織中新的生物標(biāo)志物以期預(yù)測(cè)IgAN病情的進(jìn)展和預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療將成為此研究的目的。作者選取在本院經(jīng)腎活檢明確診斷為IgAN患者的腎活檢組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)，觀察synaptopodin在IgAN患者腎組織中的表達(dá)，并探討其在腎組織分布特征、進(jìn)行相關(guān)分析，推測(cè)病情預(yù)后。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧分析2003年6月至2009年9月在本院經(jīng)腎活檢明確診斷為IgAN患者的202例腎活檢組織標(biāo)本，所有病例由一位高級(jí)職稱病理醫(yī)師獨(dú)立閱片。所有標(biāo)本已經(jīng)過(guò)苦味酸液固定、石蠟包埋，2 μm厚度切片，均行蘇木素伊紅染色(HE)、過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)、六胺銀染色(PASM)和馬松三色染色(Masson)，結(jié)合IgA等免疫熒光檢測(cè)后已確診為IgAN，所有染色標(biāo)本均在冰箱中存放。復(fù)習(xí)病歷，排除狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎及慢性肝病等繼發(fā)性IgAN病例。所有病例在當(dāng)初確診時(shí)已按Lee分級(jí)系統(tǒng)[3-5]分為Ⅰ～Ⅴ級(jí)(分類)，按分層抽樣的原則，用隨機(jī)號(hào)碼表抽取樣本，從各級(jí)中分別隨機(jī)選取10例標(biāo)本。分5組，總共標(biāo)本為50例。

1.2方法

1.2.1資料分析 對(duì)選取50例樣本，從冰箱中調(diào)出已染色的病理標(biāo)本，重新通過(guò)光鏡觀察，參照Katafuchi積分方法[6]，依據(jù)病變程度進(jìn)行積分。

1.2.2間接免疫熒光染色 從冰箱中調(diào)取出已選定的石蠟包塊，脫蠟、水洗、熱修復(fù)抗原、加一抗(Mouse Anti-IgG Synaptopodin)4 ℃ 過(guò)夜。PBS(pH7.2～7.6)洗滌2 min×3次。滴加二抗(1∶40稀釋)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG,37 ℃30 min。PBS(pH7.2～7.6)洗滌2 min×3次。

1.2.3每份腎臟病理組織同時(shí)行陰性對(duì)照。

1.2.4熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.5分析

1.2.5.1熒光圖片拍照 用免疫熒光顯微鏡觀察(×200)。把樣品放到載物臺(tái)上，快速選擇視野，每視野有一個(gè)完整的腎小球，選擇5個(gè)視野，立即拍照，在拍攝熒光照片時(shí)，確保每張照片的拍攝條件完全一致。

1.2.5.2圖片分析 對(duì)所得的照片用Imagerpro6.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析腎組織中synaptopodin的表達(dá)情況，測(cè)量每個(gè)腎小球截面總的積分光密度值(IOD SUM)及所測(cè)腎小球截面的面積(area SUM)，計(jì)算出平均光密度值[mean density=(IOD SUM)/(area sum)][7-8]。每例腎組織mean density由5個(gè)視野的相片經(jīng)圖像分析后取平均值。

1.3主要試劑及來(lái)源 synaptopodin 一抗(Mouse Anti-IgG Synaptopodin)購(gòu)自美國(guó)Fitzgerald Industries International公司。二抗(1∶40稀釋)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果計(jì)量資料列表來(lái)顯示，因所有的病例按Lee分級(jí)分為Ⅰ～Ⅴ級(jí)為多個(gè)獨(dú)立樣本的等級(jí)計(jì)量資料，所以，5組腎組織中Synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值、Katafuchi積分進(jìn)行組間比較將采取Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，通過(guò)觀察平均秩次(mean rank)來(lái)判斷組間數(shù)據(jù)變化。對(duì)synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值與Katafuchi積分進(jìn)行相關(guān)分析。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1腎組織中synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值、Katafuchi積分進(jìn)行組間比較 各組的平均光密度值見表1，經(jīng)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，從Ⅰ～Ⅴ級(jí)的平均秩次分別為44.30、35.30、26.15、16.25、5.50，H值為44.026，P<0.01；可認(rèn)為5組的平均光密度值有差異，可看出隨著病情的加重，synaptopodin的表達(dá)逐漸減少，見表2。

表1 各組間synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值

5組樣本通過(guò)光鏡觀察，參照Katafuchi積分方法，依據(jù)病變程度進(jìn)行積分，經(jīng)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)結(jié)果：從Ⅰ～Ⅴ級(jí)的平均秩次分別為7.00、16.60、23.80、34.60、45.50，H值為42.983，P<0.01；可認(rèn)為5組的Katafuchi積分值有差異，可看出隨著病情的加重，Katafuchi積分值遂漸增大，見表2。

表2 平均光密度及Katafuchi積分的各組平均秩次

2.2所有選取病例的腎臟組織中平均光密度值與Katafuchi 病理評(píng)分值間的相關(guān)性分析 通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)的Spearman相關(guān)分析，r=-0.992，P<0.01，故認(rèn)為所有選取的病例，腎臟組織中synaptopodin蛋白所表達(dá)的平均光密度值與Katafuchi 病理評(píng)分值之間呈負(fù)的直線相關(guān)。

圖1 所有病例的平均光密度與Katafuchi積分

3 討 論

Barisoni等[9]報(bào)道了synaptopodin在局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)和HIV相關(guān)性腎病表達(dá)下調(diào)，而在正常兒童與MCD患者間無(wú)差別。Kemeny等[10]觀察到在原發(fā)性FSGS早期階段synaptopodin即消失。楊琪等[8]研究發(fā)現(xiàn)，synaptopodin表達(dá)從健康人、微小病變腎病(MCD)、IgAN、系膜增殖性腎炎(MsPGN)到局灶節(jié)段性FSGS依次下降，由此推斷它的變化影響足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)腎小球疾病的進(jìn)展有重要作用。但是，對(duì)于synaptopodin的表達(dá)，目前，尚無(wú)關(guān)于IgAN病程的研究，synaptopodin能否作為反應(yīng)IgAN病理程度的一項(xiàng)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)給予了解答。

本研究發(fā)現(xiàn)，synaptopodin沿腎小球毛細(xì)血管袢呈顆粒狀、線狀表達(dá)，在硬化區(qū)無(wú)表達(dá)；從表1經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后可見從Ⅰ～Ⅴ級(jí)5組的IgAN患者，腎組織中synaptopodin所表達(dá)的平均光密度逐漸減少，也提示了IgAN患者腎組織中synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值與Lee分級(jí)一樣可以反應(yīng)病情的嚴(yán)重程度，隨著病情的加重，synaptopodin的表達(dá)逐漸減少。Katafuchi積分法[6]也可以反應(yīng)出IgAN病情的變化，從表2經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后可見，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合此變化，隨著病情的加重，Katafuchi積分的分值也逐漸增加。從圖1中可見，IgAN病程中腎組織內(nèi)synaptopodin所表達(dá)的平均光密度與Katafuchi積分呈反向相關(guān)。

足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細(xì)胞之一。而足細(xì)胞特殊結(jié)構(gòu)的維持主要依賴于以肌動(dòng)蛋白為主的細(xì)胞骨架系統(tǒng)和足細(xì)胞中表達(dá)的特異性蛋白分子。足細(xì)胞減少是疾病活動(dòng)性的重要標(biāo)志[11]。Mundel和Stuart[12]總結(jié)了各種因素引起足細(xì)胞損傷的原因：(1)裂孔隔膜復(fù)合物及脂筏的異常；(2)GBM或足細(xì)胞-GBM相互作用的影響；(3)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及其與α-actinin-4的聯(lián)系破壞；(4)足細(xì)胞喪失其表面的電荷屏障。而在actin細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白中有一種由YNPO基因編碼synaptopodin，該基因含3個(gè)外顯子。synaptopodin是一種與肌動(dòng)蛋白微絲緊密相連的富含脯氨酸的線狀蛋白。足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能之間有著密切的因果聯(lián)系，足細(xì)胞具有對(duì)抗腎小囊內(nèi)張力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。synaptopodin和α-actinin-4可以與足細(xì)胞表達(dá)的緊密連接蛋白MAGI-1相互作用而與肌動(dòng)蛋白骨架連接[13]，其基因的突變或缺失可以導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，引起蛋白尿和腎小球硬化的發(fā)生。足細(xì)胞的再生能力有限，當(dāng)足細(xì)胞損傷時(shí)，足細(xì)胞只能通過(guò)有限的增生能力代償缺失的足細(xì)胞。當(dāng)損傷進(jìn)一步加重時(shí)，足細(xì)胞從腎小球基底膜上剝脫的速度超出了足細(xì)胞的代償能力，使腎小球基底膜部分區(qū)域裸露，腎小球?yàn)V過(guò)膜的完整性遭到破壞。足細(xì)胞損傷后數(shù)量減少將導(dǎo)致腎小球硬化[14]。

在IgAN腎小球固有細(xì)胞的研究方面，以往人們重點(diǎn)關(guān)注在系膜細(xì)胞的病變，目前，越來(lái)越多的腎臟病學(xué)者對(duì)腎小球足細(xì)胞在腎病中的變化及意義進(jìn)行深入研究。Gagliardini和Benigni[15]發(fā)現(xiàn)IgAN的nephrin、podocin、podoplaninm表達(dá)減少。IgAN是一組臨床綜合征，臨床表現(xiàn)為腎病綜合征樣改變，病理上也可表現(xiàn)有新月體腎炎或硬化性腎炎，臨床表現(xiàn)多樣性。Habib等[16]研究顯示，IgAN時(shí)蛋白尿多少是影響預(yù)后的重要因素，無(wú)蛋白尿的患者預(yù)后良好。由于發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前，缺乏病因性治療手段，IgAN治療現(xiàn)狀并不令人滿意。很多研究都致力于尋找與預(yù)后或治療相關(guān)的組織學(xué)危險(xiǎn)因素。腎臟病理表現(xiàn)則能夠提供更多的信息。除了較為公認(rèn)的Haas和Lee分級(jí)系統(tǒng)，Katafuchi積分法[6]及其他多種半定量評(píng)分系統(tǒng)也得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。然而，迄今為止尚無(wú)一種分型能準(zhǔn)確地反映患者的臨床實(shí)際情況，各個(gè)分型之間也很難達(dá)成一致。傳統(tǒng)的Lee分級(jí)或Katafuchi積分存在有較大的人為主觀因素，不利于病情精確的評(píng)估及預(yù)測(cè)，特別是對(duì)于個(gè)體患者更不利于療效的觀察。

對(duì)于一些局灶節(jié)段性增生硬化型IgAN，其非硬化腎小球的病理形態(tài)呈輕微病理改變，傳統(tǒng)的Lee分級(jí)或Katafuchi積分更不能反映病情的嚴(yán)重程度，診斷時(shí)可能均被列為Ⅰ級(jí)IgAN或Katafuchi積分較低，但局灶節(jié)段性增生硬化型IgAN預(yù)后并不樂(lè)觀，甚至臨床上可表現(xiàn)為大量蛋白尿。Yang等[17]對(duì)MCD患兒18例，DMH患兒7例，F(xiàn)SGS患者13例和正常兒童7例的腎組織進(jìn)行免疫組化分析，并且用計(jì)算機(jī)圖像分析法作定量研究，得出以下結(jié)論：從MCD到FSGS，snaptopodin的表達(dá)依次減少，尤其在MCD和FSGS之間synaptopodin的表達(dá)存在顯著差異?？梢?，腎組織中synaptopodin的定量分析可對(duì)局灶節(jié)段性增生硬化型IgAN進(jìn)行區(qū)分，synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值的變化，可反應(yīng)出IgAN病情。

通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)腎組織中synaptopodin的觀察并采用圖像分析軟件對(duì)其進(jìn)行具體的量化評(píng)估。synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值更能具體及客觀地判斷IgAN病情的變化及評(píng)估預(yù)后，同時(shí)可以觀察療效。也為IgAN的研究提供一種新的指標(biāo)。

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