蔣鳳華，趙美麗，史振平，鄭 立，陳軍輝，王小如，黎先春

（1.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所海洋生態(tài)中心，山東 青島266061；2.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島266042）

中肋骨條藻在不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下的熒光光譜特征研究＊

蔣鳳華1，趙美麗1，史振平2，鄭 立1，陳軍輝1，王小如1，黎先春1

（1.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所海洋生態(tài)中心，山東 青島266061；2.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島266042）

采用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)方法，探討了營(yíng)養(yǎng)鹽條件變化對(duì)中肋骨條藻活體細(xì)胞和光合色素?zé)晒夤庾V的影響。結(jié)果表明，光合色素的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均比活體藻細(xì)胞的多一個(gè)熒光峰，且熒光峰最大值向短波方向移動(dòng)；營(yíng)養(yǎng)鹽條件改變時(shí)，活體藻細(xì)胞的熒光光譜特征基本不變，光合色素的熒光光譜特征由于色素組成比例發(fā)生變化而使熒光光譜特征發(fā)生改變。研究結(jié)果還顯示營(yíng)養(yǎng)鹽條件的改變會(huì)影響光合色素的熒光光譜特征，應(yīng)用光譜技術(shù)對(duì)赤潮藻進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析時(shí)需要考慮環(huán)境條件的影響。

赤潮藻；中肋骨條藻；熒光光譜；營(yíng)養(yǎng)鹽

（高 峻 編輯）

因?yàn)槿蛱貏e是我國(guó)近海赤潮的頻發(fā)，所以對(duì)浮游植物種類和數(shù)量的監(jiān)測(cè)分析方法的探討已成為研究的焦點(diǎn)。吸收光譜法和熒光光譜法作為常規(guī)的分析手段，可用于浮游植物種類的識(shí)別和數(shù)量的測(cè)量，對(duì)于赤潮監(jiān)測(cè)具有重要意義。藻體所含色素種類及其組成比例決定了藻類吸收譜的形狀，而色素濃度及包裹效應(yīng)主要影響吸收譜的值［1－2］。藻類熒光隨著培養(yǎng)時(shí)間［3］、光照條件［4］、營(yíng)養(yǎng)鹽條件［3］、微量元素含量［5］及污染物的存在等而變化［6－10］。熒光特性方面的研究較多，對(duì)光譜特征研究較少。國(guó)內(nèi)唐曉靜等、蘇榮國(guó)等對(duì)不同光照條件下東海典型赤潮藻的光譜特征進(jìn)行研究，并進(jìn)行藻類的識(shí)別［11－12］。赤潮發(fā)生時(shí)現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境條件的不同會(huì)引起藻類光譜的變化。我們以中肋骨條藻為研究對(duì)象，測(cè)量活體藻細(xì)胞及其光合色素的熒光光譜特征，分析營(yíng)養(yǎng)鹽條件改變對(duì)熒光光譜性質(zhì)的影響，為建立浮游植物的光譜分析方法進(jìn)行有益探索，并對(duì)赤潮的監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品與實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)所用中肋骨條藻（Skeletonemacostatum（Greville）Cleve）由國(guó)家海洋局第一海洋研究所提供，藻種于2002－05采自東海長(zhǎng)江口海域，分離純化后于20℃保存在f/2培養(yǎng)液中，光照度約為3 000Lx，光暗比為12h∶12h，光源為白色日光燈。以250mL玻璃三角瓶為培養(yǎng)容器，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為20%的HCl溶液浸泡處理后，用超純水沖洗干凈，蒸汽滅菌（121℃，15min）。海水用孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜過(guò)濾后，高壓鍋煮沸滅菌。

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在4種營(yíng)養(yǎng)鹽條件下進(jìn)行。除了f/2培養(yǎng)液條件，另3種營(yíng)養(yǎng)鹽條件為固定PO4－P濃度為2 μmol/L，使NO3－N濃度分別為16，64和128μmol/L，即N/P比分別為8∶1，16∶1和64∶1。首先在上述3種營(yíng)養(yǎng)鹽條件下對(duì)微藻進(jìn)行培養(yǎng)，然后取10mL指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接種到500mL培養(yǎng)液進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)周期15d。每組3個(gè)平行。培養(yǎng)條件與藻種保存條件相同。培養(yǎng)期間適當(dāng)振蕩，接種及取樣時(shí)均進(jìn)行滅菌處理。

實(shí)驗(yàn)期間每天定時(shí)取樣5mL藻液直接進(jìn)行微藻生長(zhǎng)和熒光光譜的測(cè)定；另取20mL藻液用GF/F濾膜過(guò)濾后，將濾膜放置于15mL玻璃離心館中，加入10mL體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮，于4℃在暗處放置24h，以提取其中的光合色素，取上清液進(jìn)行熒光光譜測(cè)量［13］。

1.2 微藻生長(zhǎng)和熒光光譜的測(cè)量

以微藻的活體葉綠素?zé)晒庵当硎疚⒃宓纳L(zhǎng)［14］。直接用Hitachi F－4500熒光分光光度計(jì)（配以1cm石英比色皿）測(cè)定活體葉綠素?zé)晒庵?，發(fā)射和激發(fā)狹縫均為5.0nm。激發(fā)波長(zhǎng)（λex）466nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）600～750nm，以680nm處的熒光強(qiáng)度（arbitrary unit，a.u.）變化表示藻的生長(zhǎng)變化。

測(cè)熒光激發(fā)光譜時(shí)，λem為680nm，λex范圍為360～600nm；測(cè)定熒光發(fā)射光譜時(shí)，λex為440nm，λex范圍為600～800nm［5，13］。掃描速度1 200nm/min。

1.3 光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理

將掃描的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出，在Matlab軟件中用窗口移動(dòng)多項(xiàng)式平滑和最大歸一化方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑和歸一化處理，以消除噪音、基線漂移和光譜強(qiáng)度的差別，處理后的光譜圖只反映樣品的光譜形狀。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)中，微藻的細(xì)胞密度和活體葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度之間存在線性關(guān)系，因而以葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化表示微藻生長(zhǎng)。中肋骨條藻活體葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化，即微藻的生長(zhǎng)符合指數(shù)生長(zhǎng)曲線，第1～3天處于緩滯期，從第4天開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。在f/2營(yíng)養(yǎng)液和N/P比例為64∶1條件下，藻的生長(zhǎng)在第10天達(dá)到最大值；而在N/P比例為16∶1和8∶1條件下，藻密度均在第6天達(dá)到最大值（圖1）。營(yíng)養(yǎng)鹽濃度越高，藻密度越大。這與劉春穎等［13］發(fā)現(xiàn)的低營(yíng)養(yǎng)鹽條件下亞心形扁藻的生長(zhǎng)狀況普遍較差相一致。

圖1 不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Skeletonemacostatumin different nutrient concentrations

1.2 不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件對(duì)中肋骨條藻熒光光譜的影響

2.2.1 熒光激發(fā)光譜

圖2為預(yù)處理前后f/2培養(yǎng)液條件下不同培養(yǎng)時(shí)間的中肋骨條藻光合色素的熒光激發(fā)光譜圖。光合色素的熒光強(qiáng)度隨藻密度增加而增大，因而不同時(shí)間的熒光光譜形狀存在較大差異；由于峰強(qiáng)高低不同，使得峰強(qiáng)較弱的光譜形狀顯現(xiàn)不出來(lái)（圖2a）。經(jīng)過(guò)平滑和歸一化處理后（圖2b），能夠有效消除受噪音、儀器影響而產(chǎn)生的平峰現(xiàn)象；消除了量的差別之后，波譜只反映了物種的形狀，有助于對(duì)比不同物種間波譜的特征差異。由于第7天時(shí)N/P比為8∶1條件下藻的生長(zhǎng)已進(jìn)入衰亡期，因而只選取第6天的光譜數(shù)據(jù)并平滑和歸一化處理后進(jìn)行比較，分析營(yíng)養(yǎng)鹽條件改變對(duì)熒光光譜的影響。

圖2 不同時(shí)期f/2培養(yǎng)液條件下中肋骨條藻光合色素的熒光激發(fā)光譜Fig.2 Fluorescence excitation spectra of photosynthetics pigments of Skeletonemacostatum in f/2culture medium in at different periods

圖3為發(fā)射波長(zhǎng)為680nm時(shí)不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下中肋骨條藻第6天時(shí)活體藻細(xì)胞和光合色素的熒光激發(fā)光譜。4種營(yíng)養(yǎng)鹽條件下熒光激發(fā)光譜形狀基本一致，熒光峰位置沒(méi)有明顯變化?；铙w細(xì)胞的熒光激發(fā)光譜在400～480nm和500～570nm出現(xiàn)2個(gè)強(qiáng)度相近的熒光寬峰，最大值分別位于440nm和530nm，在470nm處存在次大峰；分別為Chl－a、類胡蘿卜素和Chl－b的特征激發(fā)波長(zhǎng)［15］。但是，也有研究表明含有Chl－c的微藻光譜中位于綠光區(qū)468nm附近的激發(fā)峰是Chl－c的強(qiáng)峰［16］，主要是由Chl c1，c2，c3及其衍生物引起的。530～545nm的強(qiáng)吸收是類胡蘿卜素的典型吸收帶，而胡蘿卜素的吸收帶可位于425～500nm［17］。

圖3 第6天時(shí)不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下中肋骨條藻的熒光激發(fā)光譜（λem＝680nm）Fig.3 Fluorescence excitation spectra of Skeletonemacostatumin 6th day under different nutrient condition（λem＝680nm）

相對(duì)于活體細(xì)胞熒光光譜，光合色素的熒光激發(fā)光譜中2個(gè)熒光寬峰分別藍(lán)移至360～450nm和490～550nm，并且在415，510和540nm出現(xiàn)最大熒光值，分別對(duì)應(yīng)于活體細(xì)胞440nm處的葉綠素、類胡蘿卜素和褐藻黃素的典型吸收［17］，但是，510nm和540nm處的熒光強(qiáng)度比較接近，并且較415nm處的熒光強(qiáng)度明顯偏低。提取光合色素的熒光最大值和熒光最大值均向短波方向移動(dòng)，可能是由于色素提取液中細(xì)胞膜被破壞，不存在細(xì)胞色素層疊效應(yīng)的原因。

比較3種低營(yíng)養(yǎng)鹽條件下2個(gè)熒光峰范圍的熒光強(qiáng)度變化，可發(fā)現(xiàn)隨N濃度降低（64∶1降至8∶1），530nm處的熒光強(qiáng)度比值升高，即藻體中胡蘿卜素和類胡蘿卜素的比例增加。提取色素?zé)晒夤庾V中同樣是N/P為8∶1條件下類胡蘿卜素和褐藻黃素（510nm和540nm處熒光）比例相對(duì)最高。

進(jìn)一步分析光合色素?zé)晒饧ぐl(fā)光譜中415nm，510nm和540nm處熒光強(qiáng)度的比值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化（圖4）。

葉綠素與類胡蘿卜素和褐藻黃素的比例（I415nm/I510nm和I415nm/I540nm）的變化趨勢(shì)與藻生長(zhǎng)曲線相似，表明藻體內(nèi)色素組成比例與生長(zhǎng)周期有關(guān)，但是第4天比值最高。此外，f/2培養(yǎng)液條件下I415nm/I510nm和I415nm/I540nm在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)均最大，而N/P比為8∶1條件下，熒光峰強(qiáng)度的比例均最小，表明不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下藻體內(nèi)的色素組成發(fā)生了改變，而類胡蘿卜素的比例有所增加。研究表明，在環(huán)境脅迫條件下，Chl－a含量較類胡蘿卜素更敏感，即Chl－a降低幅度要大于類胡蘿卜素［17］，這可能是低營(yíng)養(yǎng)鹽條件下微藻的生長(zhǎng)受到脅迫會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧自由基，類胡蘿卜素和褐藻黃素等作為微藻體內(nèi)的抗氧化劑，其含量增加是微藻適應(yīng)環(huán)境的一種表現(xiàn)。

圖4 不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下光合色素激發(fā)光譜中2種熒光強(qiáng)度比例隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.4 The changes of 2fluorescence intensity ratioes of photosynthetic pigments with the culture time under different nutrient conditions

2.2.2 熒光發(fā)射光譜

激發(fā)波長(zhǎng)為440nm時(shí)，活體細(xì)胞的激發(fā)光譜在650～750nm范圍內(nèi)出現(xiàn)1個(gè)熒光峰，最大值在680 nm，為Chl－a的典型熒光峰（圖5a）。營(yíng)養(yǎng)鹽條件的改變對(duì)熒光峰的形狀沒(méi)有影響。但是，提取色素的激發(fā)光譜在600～750nm存在2個(gè)熒光峰（圖5b），最大值分別在636nm和669nm，分別為Chl－c和Chl－a的熒光發(fā)射峰［19］，并且光合色素?zé)晒獍l(fā)射光譜中Chl－a的位置同樣向短波方向移動(dòng)。這同樣是由于色素提取液中細(xì)胞膜被破壞，不存在細(xì)胞色素層疊效應(yīng)的原因。

圖5 第6天時(shí)不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下中肋骨條藻的熒光發(fā)射光譜Fig.5 Fluorescence emission spectra of Skeletonema costatum in 6th day under different nutrient conditions

進(jìn)一步分析不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下2個(gè)熒光峰強(qiáng)度之比（I636nm/I670nm）的變化發(fā)現(xiàn)，不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下的熒光強(qiáng)度比例不同，即營(yíng)養(yǎng)鹽條件的改變影響到Chl－a和Chl－c的相對(duì)比例（圖6）。在第3天之前，熒光峰的比值較小，這可能是由于在生長(zhǎng)初期藻密度較低，色素含量同樣很低的原因；2個(gè)熒光峰強(qiáng)度的比值在第6～8天達(dá)到最大，在衰亡期變小，同樣表明藻體內(nèi)的色素比例會(huì)隨生長(zhǎng)階段的不同而發(fā)生改變。

圖6 不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下光合色素發(fā)射光譜中熒光強(qiáng)度比例隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.6 The changes plot of fluorescence intensity ratio of photosynthetic pigments with the culture under different nutrient conditions

3 結(jié) 語(yǔ)

研究營(yíng)養(yǎng)鹽條件變化對(duì)中肋骨條藻活體細(xì)胞和光合色素的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的影響，結(jié)果表明：

1）光合色素的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均比活體藻細(xì)胞多一個(gè)熒光鋒，并且位置均較活體藻細(xì)胞向短波方向移動(dòng)；

2）營(yíng)養(yǎng)鹽條件改變時(shí)，活體藻細(xì)胞的熒光光譜特征基本不變；但是營(yíng)養(yǎng)鹽濃度較低時(shí)，藻細(xì)胞中輔助色素的比例增加，從而引起熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜發(fā)生變化。

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Study on the Characteristics of Fluorescence Spectra ofSkeletonemacostatumUnder Different Nutrient Conditions

JIANG Feng－h(huán)ua1，ZHAO Mei－li1，SHI Zhen－ping2，ZHENG Li1，CHEN Jun－h(huán)ui1，WANG Xiao－ru1，LEE FRANK S C2
（1.ResearchCenterofMarineecology，TheFirstInstituteofOceanography，SOA，Qingdao 266061，China；2.Collegeofchemicalengineering，QingdaoUniversityofScienceandTechnology，Qingdao 266042，China）

The effects of nutrient conditions on living cells and fluorescence spectra ofSkeletonemacostatumwere studied by using experimental ecological methods.An extra fluorescent peak was found in both excitation and emission spectrum of photosynthetic pigments and the positions of the fluorescence peaks of photosynthetic pigments were blue－shifted compared to those of the living cells.When the nutrient conditions changed，the characteristics of fluorescence spectra of living cells were basically kept the same，however the characteristics of fluorescence spectra of photosynthetic pigments were changed when the ratio of pigments compositions altered.The results indicated that the changes of nutrient conditions affected the characteristics of fluorescence spectra of photosynthetic pigments，and the environment conditions should be considered when applying the spectroscopic methodology to monitor and analyze red tide algae.

red tide algae；Skeletonemacostatum；fluorescence spectra；nutrient

December 15，2010

P733.3

A

1671－6647（2012）02－0229－07

2010－12－15

項(xiàng)目資助：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃——赤潮現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)（2007AA092001）；海洋赤潮災(zāi)害立體監(jiān)測(cè)技術(shù)與應(yīng)用國(guó)家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題——長(zhǎng)江口赤潮監(jiān)控區(qū)常見(jiàn)赤潮藻種光譜特性研究（200811）

蔣鳳華（1977－），山東德州人，副研究員，主要從事海洋環(huán)境化學(xué)方面研究.E－mail：jiangfh＠fio.org.cn