廖萍，羅永康，李錚，劉曉宇

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵對牛乳中β-酪蛋白抗原性的影響

廖萍，羅永康，李錚，劉曉宇

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

復原脫脂牛乳經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵至凝乳，然后在4℃下冷藏5 d。用間接競爭ELISA法測定了其中β-酪蛋白（β-CN）的抗原殘留量，并且對發(fā)酵樣品的蛋白水解程度與滴定酸度進行了分析。結果表明，復原脫脂乳經(jīng)90～95℃處理5 min后，β-CN的抗原殘留量為60.25%，發(fā)酵過程中其抗原殘留量持續(xù)下降，凝乳時下降到55.46%，而冷藏1 d后降到了最低值54.03%，隨后又緩慢上升，冷藏3 d后為55.87%，繼續(xù)冷藏至5 d，β-CN的抗原殘留量基本沒有變化，維持在55.5%與55.9%之間。因此采用德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵能夠在一定程度上降低牛乳中β-CN的抗原性，但是在冷藏5 d的過程中其抗原性又有一定程度的升高。

β-酪蛋白；德氏乳桿菌保加利亞亞種；發(fā)酵；冷藏；抗原性

0 引言

牛乳含有豐富的營養(yǎng)物質，但是大約有2%～6%的嬰幼兒會對牛乳蛋白發(fā)生不同程度的過敏[1]，嚴重影響了他們的健康成長。牛乳中主要的過敏原有酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白。Docena等[2]檢測了80位對牛乳有過敏反應病人血清的特異性，證明了酪蛋白是牛乳中最主要的過敏原。近年來，發(fā)酵乳制品調節(jié)免疫減少過敏癥狀方面的功能得到了廣泛的關注與研究[3-4]。目前通過乳酸菌發(fā)酵來降低牛乳蛋白抗原性方面的研究多見于乳清蛋白[5-7]，而關于酪蛋白的研究幾乎沒有。經(jīng)Laloi[8]與Tzvetkova[9]等證實，德氏乳桿菌保加利亞亞種對于β-CN具有較好的水解作用。本文以復原脫脂乳為發(fā)酵基質，研究其經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵后β-酪蛋白抗原性的變化，并初步分析探討了該變化的機制。

1 實驗

1.1 材料與設備

菌種為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）一株。

原料與試劑：愛爾蘭進口脫脂乳粉，β-酪蛋白（β-CN，編號C6905），HRP標記的羊抗兔IgG（效價1∶10000，編號A6154），三硝基苯磺酸（TNBS，編號P2297），兔抗β-CN血清（自制），L-亮氨酸。

儀器與設備：96孔酶標板（3590），Costar；Thermo Multiskan MK3酶標儀，164-5050基礎電泳儀，165-8001小型垂直電泳槽，YT-CJ-1ND超凈工作臺，YXQ-LS-18SI高壓蒸汽滅菌鍋，UV-2600紫外可見分光光度計，W201B電熱恒溫水浴鍋，DHP-9082生化培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵劑的制備

在已滅菌的超凈工作臺上，挑取少量德氏乳桿菌保加利亞亞種凍干粉于質量分數(shù)為12.5%復原脫脂乳培養(yǎng)基（90℃，30 min殺菌）中，充分混合均勻后置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至完全凝乳后以體積分數(shù)為2%的接種量接種于前述脫脂乳培養(yǎng)基中，充分混勻后繼續(xù)于37℃條件下培養(yǎng)。如此接種培養(yǎng)2～3代，至菌種活力完全恢復即可作為發(fā)酵劑。

1.2.2 發(fā)酵樣品的制備

將脫脂乳粉按質量分數(shù)為12.5%的比例復原為脫脂乳，經(jīng)90～95℃，5 min熱處理后，冷卻至45℃左右，在已滅菌的超凈工作臺上，將德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵劑以體積分數(shù)為2%的比例接種于復原脫脂乳中，充分混勻后于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。分別于凝乳前每隔2 h以及凝乳時取樣，凝乳后立即從培養(yǎng)箱中取出，置于4℃冰箱中冷藏，并分別于1，2，3，4，5 d后取樣。所取樣品及時攪拌均勻，分裝于小管中，-20℃凍藏待測。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物抗原性的測定

采用間接競爭ELISA方法測定發(fā)酵乳中β-CN的殘留抗原性[10]。在間接競爭ELISA中，被測抗原與包被抗原競爭性地與血清中的抗體結合，因此被測抗原的殘留抗原性大小與其OD值成反相關。將樣品均稀釋2 000倍進行測定，各被測樣的OD值記為B，未加入被測樣的無競爭體系的OD值記為B0，則β-CN的殘留抗原性可用抗原殘留量表示，按下式計算：

抗原殘留量=1-B/B0×100%。

1.2.4 滴定酸度的測定

根據(jù)國標GB 5413.34-2010測定發(fā)酵乳的滴定酸度[11]。

1.2.5 游離氨基濃度的測定

采用三硝基苯磺酸（Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）法[12]測定發(fā)酵產(chǎn)物的游離氨基濃度，以此來衡量德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶對乳蛋白的水解程度。以0～3.5×10-3mol/L的L-亮氨酸作標準曲線，通過標準曲線將吸光值轉化為樣品中游離氨基的濃度。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析[13]

濃縮膠為4%，分離膠為15%。用去離子水將蛋白質質量濃度調節(jié)為2 g/L左右，進樣量為10 μL。采用恒壓（濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V）進行電泳。

2 結果與討論

2.1 脫脂乳發(fā)酵與冷藏過程中β-CN抗原性的變化

發(fā)酵樣品的抗原殘留量如圖1所示。由圖1可以看出，德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵復原脫脂乳，在發(fā)酵至凝乳的過程中，β-CN的抗原殘留量逐漸下降，凝乳后冷藏1 d，其抗原殘留量繼續(xù)下降至最低，隨后冷藏至5 d的過程中，β-CN的抗原殘留量又有緩慢上升的趨勢。脫脂乳經(jīng)90～95℃、5 min熱處理后，β-CN的抗原殘留量為60.25%，發(fā)酵2，4，6h，其抗原殘留量持續(xù)下降，凝乳時（發(fā)酵約8 h）的抗原殘留量降低為55.46%。在冷藏過程中，β-CN的抗原殘留量呈現(xiàn)先下降后緩慢上升的趨勢，冷藏1 d后降到最低，為54.03%，繼續(xù)冷藏至3 d，其抗原性緩慢上升到55.87%，之后的冷藏過程基本沒有變化，維持在55.5%和55.9%之間。

2.2 脫脂乳發(fā)酵與冷藏過程中乳蛋白水解程度的測定

發(fā)酵樣品的游離氨基濃度與其SDS-PAGE分析結果分別如圖2與圖3所示。圖3中，MW為低分子量蛋白Marker；1為熱處理后；2為發(fā)酵4 h；3為凝乳時；4為冷藏1 d；5為冷藏3 d；6為冷藏4 d；7為冷藏5 d。

由圖2可以看出，復原脫脂乳經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵，游離氨基濃度在發(fā)酵過程中逐漸升高，進入冷藏過程之后，前2 d略微升高，然后稍有降低。經(jīng)90～95℃，5 min熱處理后的脫脂乳中的游離氨基濃度為15.88 mmol/L，發(fā)酵4 h逐漸上升到17.56 mmol/L，凝乳時已達到21.85 mmol/L。在冷藏的前2 d，游離氨基濃度繼續(xù)上升，冷藏2 d時濃度為22.96 mmol/L，然后有所下降，最后冷藏5 d時濃度為21.17 mmol/L。由于在發(fā)酵過程中德氏乳桿菌保加利亞亞種的蛋白酶作用于乳蛋白，才使得發(fā)酵乳中的游離氨基濃度逐漸升高，而冷藏過程中由于溫度較低，蛋白酶的水解作用受到抑制，因此冷藏2 d以后游離氨基濃度不僅沒有上升，還有小幅度的下降。另外根據(jù)圖3可知，在脫脂乳的整個發(fā)酵與冷藏過程中，β-CN的條帶雖沒有明顯淡化，卻有較低分子量的新條帶生成，并有逐漸加深的趨勢，這個新條帶有可能是酪蛋白在德氏乳桿菌保加利亞亞種的蛋白酶作用下發(fā)生一定程度的水解而產(chǎn)生的。研究表明，德氏乳桿菌保加利亞亞種的蛋白水解系統(tǒng)按功能可分為3個部分：結合在細胞壁上的蛋白酶（將蛋白水解為多肽）、多肽轉運系統(tǒng)（將多肽轉運到細胞內(nèi)）與細胞內(nèi)的肽酶[14]。Laloi等[8]采用α-酪蛋白（α-CN）與β-CN溶液作為發(fā)酵基質，證明德氏乳桿菌保加利亞亞種CNRZ397細胞壁上的蛋白酶對α-CN與β-CN均有水解作用，β-CN比α-CN水解得更快，并且將此蛋白酶進行了分離，得到了其最適溫度為42℃，最適pH值為5.5。Tzvetkova等[9]分別采用酪蛋白酸鈉、β-CN和乳清蛋白作為發(fā)酵基質，研究了21株德氏乳桿菌保加利亞亞種對它們的水解作用，結果表明所有的菌株都對β-CN有不同程度的水解能力，而其水解其他幾種乳蛋白（α-CN、α-乳白蛋白與β-乳球蛋白）的能力不如水解β-CN的能力強。本研究采用脫脂乳作為發(fā)酵基質,按實際生產(chǎn)中的流程進行發(fā)酵與冷藏。可能由于牛乳中酪蛋白膠束結構的復雜性，β-CN被水解的程度并不如采用β-CN溶液或者酪蛋白酸鈉作為發(fā)酵基質的明顯。德氏乳桿菌保加利亞亞種對β-CN的水解作用也許可以解釋其在發(fā)酵過程中以及冷藏前期抗原性降低的原因，由于β-CN的水解導致其一些構象表位或線性表位受到破壞，與血清中相應抗體的結合能力減弱，因此使得通過間接競爭ELISA所表征的抗原性得到了降低。低溫冷藏進入到后期，可能由于酪蛋白的水解產(chǎn)物的增多，β-CN的一些隱蔽表位被暴露或者產(chǎn)生了一些新的表位，使得β-CN抗原性有一些升高。

2.3 脫脂乳發(fā)酵與冷藏過程中滴定酸度的變化

圖4為發(fā)酵樣品的滴定酸度。由圖4可以看出，脫脂乳經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵的過程中，其滴定酸度一直呈上升狀態(tài)，進入冷藏過程之后，基本無多大變化。在牛乳中，80%～95%的酪蛋白是以膠束形式存在的，酪蛋白膠束包含94%的酪蛋白與6%的膠態(tài)磷酸鈣。隨著牛乳酸度的上升，膠態(tài)磷酸鈣從酪蛋白膠束中溶出，變?yōu)榭扇苄粤姿徕}，從而使酪蛋白膠束的穩(wěn)定性下降，酪蛋白發(fā)生凝集沉淀。同時部分酪蛋白也會從膠束中分離，使得乳清中的酪蛋白質量分數(shù)升高[16]。Law等[16]在不同溫度下將脫脂乳酸化到不同的pH值后再于該溫度下貯藏24 h，研究了乳清中的酪蛋白占總酪蛋白的百分比，結果表明其中β-CN與κ-酪蛋白（κ-CN）的溶出率是比較高的。在脫脂乳發(fā)酵與冷藏過程中，隨著滴定酸度的上升，pH值的下降，脫脂乳中酪蛋白膠束的凝集沉淀、乳清中可溶性磷酸鈣以及酪蛋白質量分數(shù)的上升，可能會造成β-酪蛋白中構象表位或線性表位的隱藏或者暴露，從而使其抗原性發(fā)生一定程度的變化。而由于采用間接競爭ELISA測定β-CN的抗原性時，發(fā)酵樣品需用磷酸鹽緩沖液（pH值為7.4）進行稀釋，相當于將酸化后的牛乳進行中和，發(fā)酵樣品中的酪蛋白的狀態(tài)可能會發(fā)生改變。Lucey等[17]采用將牛乳在低溫下先酸化到pH值為5.0或者4.6，后中和到pH值為6.6的方式，研究了牛乳中酪蛋白膠束的物理化學特性。結果表明這個過程對酪蛋白膠束來說是不可逆的，在酸化過程中酪蛋白膠束已經(jīng)發(fā)生分解，后面的中和過程也不會使它最終復原。

2.4 β-CN的抗原性與其游離氨基濃度及滴定酸度的相關性

脫脂乳進行熱處理后，經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵至凝乳這一過程中，乳中β-CN的抗原殘留量與其游離氨基濃度及滴定酸度的關系曲線圖分別如圖5和圖6所示（圖中的每個點代表熱處理后或發(fā)酵中各時間點的乳樣）。由圖5和圖6可以看出，脫脂乳在發(fā)酵過程中β-CN的抗原殘留量與其游離氨基濃度和滴定酸度之間均存在顯著的負相關性，決定系數(shù)R2分別為0.8051和0.8089。這種相關性的存在說明β-CN抗原性的降低有兩種可能的原因：一是德氏乳桿菌保加利亞亞種細胞壁上的蛋白酶水解β-CN，使得一些構象表位或者線性表位受到破壞；二是酸度逐漸增大使得酪蛋白膠束的狀態(tài)發(fā)生改變，使得β-CN的一些構象表位或線性表位得到隱藏或者暴露。β-CN抗原性的降低可能是這兩種原因共同作用的結果，使得其抗原性總體上來說得到了降低。

3 結論

脫脂乳經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵至凝乳，其β-CN的抗原性在一定程度上得到了降低。凝乳后冷藏5 d的過程中，冷藏1 d時其抗原性降到最低，隨后有緩慢上升的趨勢，但最終穩(wěn)定在一定水平。

由于本文在2012年第2期（4-7頁）刊出時圖片刊發(fā)錯誤，為便于讀者閱讀時對照圖文，因此在本期重新刊發(fā)全文。對由于我們工作失誤對作者、讀者造成的不良影響及不便，我們表示由衷的歉意，希望能得到作者的諒解并繼續(xù)支持關注本刊。

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Effect of fermentation with Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus on the antigenicity of β-casein in cow’s milk

LIAO Ping，LUO Yong-kang，LI Zheng，LIU Xiao-yu
(Food Science and Nutritional Engineering College，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Reconstituted skimmed milk was fermented to form into curd withLactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus,then stored at 4℃for 5 days.The residual antigenicity of β-casein(β-CN)in it was estimated by indirect competitive ELISA method,the hydrolysis degree of milk proteins and titratable acidity were analysed as well.The results indicated that,after processing in 90～95℃for 5 min,the residual antigenicity of β-CN was 60.25%,and it decreased throughout the fermentation,to 55.46%when the milk formed into curd.The lowest antigenicity 54.03%appeared when the milk was stored at 4℃for 1 day,then it went up slightly to 55.87%when the storage time extended to 3 days. Followed by storage in 4℃to 5 days,the residual antigenicity of β-CN remained between 55.5%and 55.9%.It was proved that fermentation withLactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus could reduce the antigenicity of β-casein in cow’s milk to some extent,but it goes up a little when the ferment product is stored in 4℃for 5 days.

β-casein;Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus;fermentation;refrigeration;antigenicity

Q935，TS252.1

A

1001-2230（2012）03-0011-04

2011-08-31

國家自然科學基金（31171715；30871817）。

廖萍（1987-），女，碩士研究生，主要從事乳品科學方面的研究。

羅永康