馬恩波，葛娉婷，張建琴，張建珍

（山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西 太原 030006）

飛蝗兩種群羧酸酯酶及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性與馬拉硫磷敏感性關(guān)系的研究

馬恩波，葛娉婷，張建琴，張建珍

（山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西 太原 030006）

對(duì)飛蝗天津北大港種群及河北滄州種群進(jìn)行了生物測(cè)定與生化水平的比較分析，生物測(cè)定結(jié)果顯示，天津北大港種群對(duì)馬拉硫磷的LD50值為河北滄州種群的13.2倍，顯示天津北大港種群已對(duì)馬拉硫磷產(chǎn)生了耐藥性.兩種群羧酸酯酶比活力分析表明，以α－醋酸萘酯（α-NA）為底物時(shí)，兩種群羧酸酯酶比活力無顯著差異;以α－丁酸萘酯（α-NB）和β－醋酸萘酯（β-NA）為底物時(shí)，飛蝗天津北大港種群較河北滄州種群羧酸酯酶比活力為低，且具有顯著差異.以1氯-2，4-二硝基苯（CDNB）為底物對(duì)兩種群谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，河北滄州種群谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力高于天津北大港種群.以上結(jié)果顯示，天津北大港種群對(duì)馬拉硫磷的耐藥性，可能與羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶沒有直接的相關(guān)性，而與靶標(biāo)敏感性的下降有關(guān).

飛蝗;羧酸酯酶;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶;馬拉硫磷

飛蝗（Locustamigratoria）主要以中生和半濕生性禾本科植物為食，如蘆葦（Phragmitescommunis），稗草（Echinochloacrusgall），莎草（Cyperusrotundus）等，由于其暴發(fā)性和遷飛性特點(diǎn)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅［1］.自1983年Georghiou等［2］報(bào)道昆蟲對(duì)DDT產(chǎn)生抗性以來，已發(fā)現(xiàn)多種農(nóng)林害蟲對(duì)常用化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性，如：小菜蛾（Plutellaxylostella），庫(kù)蚊（Culex），桃蚜（Myzuspersicae）等.本課題組曾報(bào)道東亞飛蝗已對(duì)馬拉硫磷產(chǎn)生了一定程度的抗藥性，害蟲產(chǎn)生抗藥性與體內(nèi)代謝酶系的解毒能力增強(qiáng)和靶標(biāo)酶不敏感性有關(guān)［3］.

已有學(xué)者開展了昆蟲羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶生化方面的研究，孫魯娟等［4］比較了不同底物作用下室內(nèi)培養(yǎng)的抗樂果棉蚜品系與敏感品系酯酶比活力，發(fā)現(xiàn)以α-NA和α-NB作底物時(shí)，抗性品系棉蚜的比活力顯著低于敏感品系，Taskin等［5］研究了家蠅（Muscadomestica）馬拉硫磷特異性羧酸酯酶 MCE的活性，發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷抗性品系中的 MCE活性明顯高于敏感品系.Leeuwen等［6］測(cè)定了田間多抗二斑葉螨（Tetranychusurticae）酯酶活性，發(fā)現(xiàn)抗性種群中的酶活性較敏感品系為高.Achaleke等［7］發(fā)現(xiàn)抗擬除蟲菊酯的棉鈴蟲酯酶活性高于敏感品系.本課題組前期研究表明，東亞飛蝗河北黃驊田間種群對(duì)馬拉硫磷產(chǎn)生抗藥性由多種機(jī)制造成，包括酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶解毒能力的增強(qiáng)和乙酰膽堿酯酶敏感性的下降［8－10］.郭麗等［11］測(cè)定不同濃度敵敵畏作用下德國(guó)小蠊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性，結(jié)果顯示隨著施藥濃度增加谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性逐漸降低，認(rèn)為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是敵敵畏的重要代謝酶.宣濤等［12］從東亞飛蝗5齡若蟲中分離純化出24 k Da的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，并對(duì)其基本特性進(jìn)行了分析，同年又對(duì)東亞飛蝗不同齡期解毒酶和靶標(biāo)酶活性做了研究［13］.

本文采用生物測(cè)定及羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶酶活性檢測(cè)方法對(duì)飛蝗天津北大港種群和河北滄州種群進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥耐藥性水平的檢測(cè)及羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶生化機(jī)制的初步探討，為蝗蟲治理提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

飛蝗河北滄州種群蝗卵由河北滄州蝗蟲飼養(yǎng)公司提供，天津北大港種群于2009年6月采自天津北大港，并在室內(nèi)飼養(yǎng)一代作為實(shí)驗(yàn)材料.兩種群均在25 cm×25 cm×25 cm規(guī)格的鐵紗籠中飼養(yǎng)，用新鮮麥苗飼喂，每天換1－2次小麥，選取活力旺盛的若蟲作為實(shí)驗(yàn)材料.

1.2 飛蝗生物測(cè)定

采用點(diǎn)滴法測(cè)定飛蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感性，用丙酮將馬拉硫磷原藥稀釋成5個(gè)適當(dāng)?shù)臐舛龋ê颖睖嬷莘N群：0.3、0.15、0.05、0.025、0.012 5 mg／m L.天津北大港種群：3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg／m L），用微量移液器取3μL稀釋農(nóng)藥點(diǎn)滴于2齡飛蝗若蟲第2－3腹節(jié)之間，每個(gè)濃度點(diǎn)滴17－19頭，雌雄各半，河北滄州種群每組2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，天津北大港種群每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，對(duì)照組均點(diǎn)滴3μL丙酮.室溫飼養(yǎng)24 h后觀察死亡情況，輕觸蟲體不動(dòng)為死亡.記錄各個(gè)濃度的試蟲數(shù)和死亡數(shù).用SPSS統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行回歸分析，求出飛蝗對(duì)有機(jī)磷的LD50值.

1.3 酶活性測(cè)定

1.3.1 粗酶液提取

測(cè)定飛蝗兩種群羧酸酯酶（Car Es）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性，河北滄州種群選取活力旺盛的5齡飛蝗20頭，雌雄各半.天津北大港種群選取30頭，雌雄各半.取其胸部，單頭勻漿.

1.3.2 羧酸酯酶活性測(cè)定

分別以α-NA、β-NA和α-NB為底物測(cè)定羧酸酯酶活性，步驟同文獻(xiàn)［14］測(cè)定羧酸酯酶活性的方法.

1.3.3 羧酸酯酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km、Vmax值的測(cè)定

以α-NA、α-NB和β-NA為底物測(cè)定羧酸酯酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)，采用0.1 mol·L－1、p H 7.5的磷酸緩沖液以2倍梯度稀釋底物，使底物在反應(yīng)體系中的終濃度依次為0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4 mmol·L－1，其它操作步驟及酶活力計(jì)算方法同1.3.2.采用 Hanes plot方法［15］計(jì)算Km和Vmax值.

1.3.4 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定

以CDNB為底物測(cè)定谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性，具體操作步驟同Yang等［16］的測(cè)定方法.

1.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法同Smith等［17］的方法，用牛血清白蛋白BCA作為標(biāo)品，560 nm處讀取OD值.

2 結(jié)果

2.1 兩種群對(duì)馬拉硫磷敏感性的比較

飛蝗天津北大港種群及河北滄州種群對(duì)馬拉硫磷的LD50值分別為48.15和3.66μg／g蟲重.天津北大港種群比河北滄州種群對(duì)馬拉硫磷的敏感性降低了13.2倍（表1，P385）.

2.2 兩種群羧酸酯酶活性和動(dòng)力學(xué)比較

對(duì)飛蝗兩種群進(jìn)行羧酸酯酶活性檢測(cè)，結(jié)果表明，以α-NA為底物時(shí)，飛蝗河北滄州種群和天津北大港種群羧酸酯酶比活力沒有顯著差異（P＞0.05）.以α-NB和β-NA為底物時(shí)，河北滄州種群羧酸酯酶比活力高于天津北大港種群，分別為1.29和1.37倍，且有顯著差異（P＜0.05），如圖1-A（P385）所示.

兩種群羧酸酯酶動(dòng)力學(xué)研究表明，飛蝗河北滄州種群和天津北大港種群的羧酸酯酶對(duì)α-NA、α-NB和β－NA 3個(gè)底物均具有水解活性，其相應(yīng)的Km和Vmax值在兩種群中均無顯著差異（P＞0.05），如表2（P385）所示.但同一種群內(nèi)，與3個(gè)底物的Km值相比，以α-NA為底物時(shí)Km最小，表明飛蝗羧酸酯酶的最適底物是α-NA.以α-NA為底物時(shí)，天津北大港種群的Km和Vmax值分別是河北滄州種群的0.99和0.77倍;以α-NB為底物時(shí)，天津北大港種群的Km和Vmax值分別是河北滄州種群的1.37和0.83倍.以β-NA為底物時(shí)，天津北大港種群的Km和Vmax值分別是河北滄州種群的1.41和0.88倍.

表1 兩種群對(duì)馬拉硫磷敏感性的比較Table 1 Comparison of malathion susceptibility of Locustamigratoria from two populations

圖1 兩種群羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活性的比較Fig.1 Comparisons of specific activities of Car Es and GSTs in two populations of L.migratoria

表2 兩種群羧酸酯酶動(dòng)力學(xué)比較aTable 2 Kinetic parameters of Car Es in two populations

2.3 兩種群谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的比較

對(duì)飛蝗兩種群進(jìn)行谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)，結(jié)果表明，以CDNB為底物時(shí)，飛蝗河北滄州種群谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力高于天津北大港種群，為1.18倍，且有差異顯著（P＜0.05，圖1-B）.

3 討論

天津北大港是我國(guó)重要的沿海及濱湖蝗區(qū)，飛蝗連年發(fā)生，化學(xué)農(nóng)藥防治頻繁.為檢測(cè)這一田間種群對(duì)殺蟲劑是否產(chǎn)生耐藥性，研究羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在有機(jī)磷殺蟲劑耐藥性產(chǎn)生中的功能作用，本課題組于2009年6月進(jìn)行了田間飛蝗采集，并開展了一系列生化與分子水平的研究.馬拉硫磷生物測(cè)定結(jié)果顯示飛蝗天津北大港種群比河北滄州種群對(duì)馬拉硫磷的敏感性降低了13.2倍.馬拉硫磷的選擇壓力是引起這兩個(gè)種群對(duì)馬拉硫磷敏感性差異的主要原因.對(duì)于河北滄州種群，該蝗蟲飼養(yǎng)公司采用大棚內(nèi)養(yǎng)殖飛蝗，農(nóng)藥選擇壓力小;而天津北大港種群化學(xué)農(nóng)藥噴灑頻繁，因而該種群對(duì)馬拉硫磷的敏感性較河北滄州種群為低.

羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲產(chǎn)生代謝抗性的重要酶系.羧酸酯酶是酯酶的一大類家族酶，酯酶在昆蟲體內(nèi)的解毒機(jī)制主要是將包含酯鍵的內(nèi)源性和外源性化合物分解為相應(yīng)的醇和酸［18］.目前使用的大多數(shù)殺蟲劑均屬于酯類化合物，因此酯酶在昆蟲降解殺蟲劑方面扮演著重要的角色［19］.GSTs是生物體內(nèi)的一類Ⅱ相代謝酶，能使有害的親電物質(zhì)與內(nèi)源的還原型谷胱甘肽（GSH）結(jié)合，使之更易于排出體外［12，20］.GSTs主要介導(dǎo)有機(jī)磷、擬除蟲菊酯和DDT等的抗性，已有研究顯示昆蟲殺蟲劑抗性水平與GSTs活性水平相關(guān)［12－13，20－21］.

羧酸酯酶比活力研究結(jié)果顯示以α-NA為底物時(shí)，兩種群羧酸酯酶比活力沒有顯著差異（P＞0.05），以α-NB和β-NA為底物時(shí)，飛蝗天津北大港種群較河北滄州種群羧酸酯酶比活力為低，且有顯著差異（P＜0.05）.分析認(rèn)為該種群對(duì)馬拉硫磷的耐藥性可能與羧酸酯酶活性沒有直接的相關(guān)性.表2結(jié)果顯示：兩種群α-NA、α-NB和β-NA的羧酸酯酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值均沒有顯著差異（P＞0.05）.表明羧酸酯酶可能沒有在影響酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生突變.本實(shí)驗(yàn)室采用Real-time PCR方法檢測(cè)飛蝗羧酸酯酶基因在河北滄州種群和天津北大港種群m RNA的差異表達(dá)，結(jié)果顯示25個(gè)羧酸酯酶基因在兩種群中均沒有顯著差異（數(shù)據(jù)未列出），表明羧酸酯酶不同家族基因間mRNA相對(duì)表達(dá)量也沒有發(fā)生明顯改變.分析認(rèn)為，兩種群對(duì)馬拉硫磷的敏感性差異可能與羧酸酯酶沒有直接的相關(guān)性.

以CDNB為底物對(duì)飛蝗兩種群谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示飛蝗河北滄州種群谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力比天津北大港種群酶活性為高.賈苗等［22］對(duì)9個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的mRNA水平表達(dá)分析也顯示河北滄州種群高于天津北大港種群，表明兩種群對(duì)馬拉硫磷的敏感性差異可能與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶也沒有直接的相關(guān)性.

根據(jù)以上研究結(jié)果推測(cè)兩種群對(duì)馬拉硫磷的敏感性差異很可能與靶標(biāo)敏感性下降有關(guān).李飛等［23］發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶活性在抗性棉蚜品系中顯著下降，表明棉蚜抗性品系體內(nèi)代謝抗性和靶標(biāo)抗性同時(shí)存在，不同抗性水平二者所起的作用不同.郭麗等［11］的研究表明敵敵畏對(duì)德國(guó)小蠊乙酰膽堿酯酶有抑制作用，即乙酰膽堿酯酶的敏感性下降對(duì)敵敵畏產(chǎn)生抗性.吳?；ǖ龋?4］的研究也表明中華稻蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感性可能與乙酰膽堿酯酶的不敏感性有關(guān).本文所研究的天津北大港種群對(duì)馬拉硫磷的耐藥性機(jī)制還有待于更進(jìn)一步的驗(yàn)證.綜上所述，飛蝗對(duì)馬拉硫磷產(chǎn)生耐藥性是多種因素作用的結(jié)果，因此，對(duì)飛蝗耐藥性機(jī)制應(yīng)進(jìn)行全面的研究.

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Activities of Carboxylesterases and GlutathioneS-transferases Related to Malathion Susceptibility in two Populations ofLocustamigratoria

MA En-bo，GE Ping-ting，ZHANG Jian-qin，ZHANG Jian-zhen
（InstituteofAppliedBiology，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

A series of comparative analysis including bioassay，biochemical studies to the locust collected from Tianjin beidagang and Hebei cangzhou were conducted.The bioassay indicated that Tianjin Beidagang population was tolerance to malathion（tolerance ratio＝13.2）.The carboxylesterases（Car Es）specific activity withα-naphthyl butyrate（α-NB）andβ-naphthyl acetate（β-NA）substrates of the Hebei Cangzhou population was significantly higher compared with Tianjin Beidagang population.While theα-naphthyl acetate（α-NA）was used as substrate，the significant difference of Car Es specific activity between two populations was not detected.The specific activity of glutathioneS-transferases（GSTs）of Hebei Cangzhou population was significantly higher than these of Tianjin Beidagang population when 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（CDNB）was used as substrate.All these results suggested that the observed tolerance to malathion in the Tianjin Beidagang population was not conferred by the Car Es and GSTs，but possibly related to the reduction of the target sensitivity.

Locustamigratoria;Carboxylesterase;GlutathioneS-transferases;malathion

Q965

A

2011-11- 26;

2011-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金重大國(guó)際合作項(xiàng)目（30810103907）;國(guó)家自然科學(xué)基金（30870302）;山西省自然科學(xué)基金（2011011033-1）;公益性農(nóng)業(yè)科研項(xiàng)目（200903021）

馬恩波（1953－），女，山西交城人，博士，教授，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物生化與分子生物學(xué).E-mail：maenbo2003＠sxu.edu.cn