劉化俠 魏寅翼 胡曉旭 萬學(xué)英 李 蕾

(泰山醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，山東 泰安 271016)

天然牛黃 (natural calculus bovis, NCB) 是珍貴的中藥材，主要含膽汁酸、膽色素、肽類物質(zhì)、氨基酸、多種微量元素及維生素D和類胡蘿卜素等多種活性物質(zhì)。研究顯示其具有良好的解熱鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和免疫增強(qiáng)作用[1]，但機(jī)制未明。由于天然牛黃資源奇缺，價(jià)格昂貴，因此研發(fā)天然牛黃的替代品是解決資源不足的主要途徑之一。酶育牛黃(culculus bovis cultivated by glucuronidase, CBCG)是泰山醫(yī)學(xué)院自行研制的一種在體外培育的牛黃[2]，高效液相電化學(xué)法(HPLC) 檢測發(fā)現(xiàn)其膽紅素含量明顯高于天然牛黃， 膽酸類成分與天然牛黃相當(dāng)；HPLC-ELSD指紋圖譜進(jìn)一步證實(shí)制備工藝穩(wěn)定。初步研究發(fā)現(xiàn)酶育牛黃在抗炎、解熱鎮(zhèn)痛方面的藥理效應(yīng)與天然牛黃相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)旨在初步探討酶育牛黃的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用，為酶育牛黃抗腫瘤的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 動(dòng)物：昆明種小鼠50只，體重20～26 g，清潔級(jí)。動(dòng)物合格證號(hào)：0011932。小鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，由泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 藥品： CBCG：由泰山醫(yī)學(xué)院周廣禮教授提供。注射用環(huán)磷酰胺：山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：04110605。肉瘤S180細(xì)胞：上海博全爾生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1牛黃混懸液的制備 取淀粉1 g加入100 ml蒸餾水，煮沸，室溫冷卻。加入適量CBCG，即得酶育牛黃混懸液。

1.2.2體外實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1含藥血清的制備 取Wistar大鼠8只，雌雄各半，每天分別灌胃給予牛黃混懸液2 g/kg或腹腔注射CTX 20 mg/kg，連續(xù)7天，最后一次給藥后2小時(shí)，水合氯醛麻醉，心臟取血，無菌分離血清，56℃、30 min滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

2.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1酶育牛黃對(duì)小鼠肉瘤S180的體內(nèi)抑制作用 從表1可以看出，模型組小鼠體內(nèi)腫瘤的平均瘤重明顯增加；連續(xù)給予酶育牛黃10天劑量依賴性地抑制腫瘤生長，中劑量和高劑量組明顯使平均瘤重減輕，與模型組相比，差異具有顯著性。環(huán)磷酰胺組的抑瘤率達(dá)到74.24%，顯示出較好的抑瘤作用。

表1 酶育牛黃對(duì)小鼠肉瘤S180的體內(nèi)抑制作用(n=10)

注：與模型組比較，***P<0.001。

2.1.2CBCG對(duì)免疫器官的影響 與模型組比較，酶育牛黃各組脾和胸腺指數(shù)均有所增加，且呈現(xiàn)劑量依賴，其中高劑量組能夠明顯提高免疫器官重量，與模型組相比，差異具有顯著性。環(huán)磷酰胺組，脾指數(shù)及胸腺指數(shù)均有所降低，結(jié)果見表2。

表2 酶育牛黃對(duì)小鼠免疫器官的影響(n=10)

注：與模型組比較，***P<0.001，###P<0.001。

2.2體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1CBCG含藥血清對(duì)S180的生長抑制作用 酶育牛黃含藥血清處理24或48小時(shí)，肉瘤S180細(xì)胞生長受到抑制，其作用隨含藥血清濃度的增加而增強(qiáng)。10%、20%、30%酶育牛黃組和10%環(huán)磷酰胺組效果尤為明顯，與對(duì)照組比較，具有顯著性差異，結(jié)果見圖1，2。

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001。

圖1 CBCG含藥血清作用24小時(shí)抑制S180細(xì)胞增殖率

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05 ,**P<0.01,***P<0.001 。

圖2 CBCG含藥血清作用48小時(shí)抑制S180細(xì)胞增殖率

2.2.2CBCG含藥血清對(duì)脾細(xì)胞的促增殖作用 酶育牛黃含藥血清作用24或48小時(shí)可促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，且其增殖程度與血清濃度、作用時(shí)間呈正相關(guān)。7.5%、10%、20%、30%酶育牛黃組效果明顯，與對(duì)照組比較，具有顯著性差異。環(huán)磷酰胺組對(duì)脾細(xì)胞增殖具有抑制作用，結(jié)果見圖3，4。

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001。

圖3 CBCG含藥血清作用24小時(shí)促脾細(xì)胞率

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01,***P<0.001。

圖4 CBCG含藥血清作用48小時(shí)促脾細(xì)胞率

3 討 論

惡性腫瘤是二十一世紀(jì)人類健康的第一殺手。目前對(duì)惡性腫瘤的治療還沒有特效藥，從中藥復(fù)方或制劑中開發(fā)研制新的抗腫瘤藥成為惡性腫瘤治療的重要課題之一。牛黃常被制成復(fù)方制劑如犀黃丸(西黃丸)等, 用于各種惡性腫瘤如肝癌的治療。研究發(fā)現(xiàn)，牛黃和人工牛黃都有增強(qiáng)免疫和抗腫瘤的作用，抑瘤率在30%～72.2.%[1，3-4]。但目前對(duì)牛黃及其復(fù)方制劑的抗腫瘤研究主要集中在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究，對(duì)體外及細(xì)胞的抗腫瘤研究鮮有報(bào)道。而且，牛黃復(fù)方制劑產(chǎn)生的抗腫瘤作用是否來自于多種成分的復(fù)合效應(yīng)還是單純牛黃的作用也未見報(bào)道。 本研究主要從免疫機(jī)制著手，探討我們自主研制的酶育牛黃在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用，同時(shí)采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探討其作用機(jī)制。

研究結(jié)果顯示：酶育牛黃在小鼠體內(nèi)外均呈現(xiàn)較好的抗腫瘤作用，酶育牛黃高劑量組對(duì)抑瘤率的影響超出了“抗癌藥體內(nèi)藥效試驗(yàn)規(guī)程”所限定的30%標(biāo)準(zhǔn)[5]。酶育牛黃組抑瘤率雖略低于陽性對(duì)照藥組，但其未出現(xiàn)環(huán)磷酰胺組的免疫抑制作用，相反其促進(jìn)免疫器官代償性增大(圖3,4)。本研究的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。由此可見，酶育牛黃不僅具有良好的抑制瘤細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)具有促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖的作用。本研究為酶育牛黃的抗腫瘤機(jī)制的深入研究提供了研究基礎(chǔ)，也為開發(fā)新型抗腫瘤藥提供了理論依據(jù)。

[1] 遲程，遲萍. 中國牛黃43年(1949-1992)研究動(dòng)態(tài)[J]. 中國民族民間醫(yī)藥雜志，1996,18(1):27-35.

[2] 周廣禮，張豐雪，朱長義.以大腸桿菌B-葡萄糖醛酸酶培育牛黃實(shí)驗(yàn)研究[J]. 泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991,12(1):13-14.

[3] 田彥玲，劉京生.牛黃天龍方藥對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響及其抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].河北醫(yī)藥，2009,31(23)：3184-3185.

[4] 汪世元，陳孝平，蔡紅嬌，等.外培育牛黃誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，34(6)：754.

[5] 潘啟超.腫瘤藥理學(xué)及化學(xué)治療學(xué)[M].廣州：廣東高等教育出版社,1989:432.