周文佳， 王 蒙， 黃 明， 華雯妍， 張全英

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗研究室，江蘇蘇州215004)

福辛普利是唯一含次磷酸基團的血管緊張素轉換酶抑制劑，主要用于治療高血壓、心力衰竭等疾病，由于可經肝、腎雙途徑清除，安全性好，故近年來其在臨床上的應用及相關研究日益增多。福辛普利為酯類前藥，本身對血管緊張素轉換酶的抑制作用較弱，口服后在胃腸黏膜和肝臟迅速并完全水解為具有藥理活性的代謝產物福辛普利拉，后者通過其次磷酸基團與血管緊張素轉換酶活性部位中鋅離子結合，從而抑制血管緊張素轉換酶活性［1］。雖然已有文獻報道福辛普利拉的血藥濃度測定方法，但其樣本處理大多采用液－液萃取法［2-3］或固相萃取法［4］，繁瑣耗時。本文則采用簡便、快速、低耗的甲醇直接沉淀蛋白法處理血漿樣本，并建立LC-MS/ MS法測定福辛普利拉血藥濃度，考察福辛普利鈉片經中國健康志愿者口服后的藥動學特性。

1 材料

1.1 藥品與試劑

福辛普利鈉片(蒙諾?，規(guī)格:10 mg/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號:1007090);福辛普利拉對照品(含量:99.8%，浙江華海藥業(yè)股份有限公司，批號:20100315);瑞巴派特(內標，含量: 99.9%，蘇州天馬醫(yī)藥集團天吉生物制藥，批號: 0180606003)。甲醇為色譜純，氨水和醋酸銨為分析純，水為去離子水。

1.2 儀器

API-4000型三重四極桿串聯質譜儀(美國AB公司)，數據處理系統(tǒng)為Analyst 1.4.2;Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱:WATERS XTerra?RP18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);柱溫:48℃;流動相:6 mmoL·L－1醋酸銨水溶液(用氨水調節(jié)至 pH10.2)－甲醇(57∶43);流速:1.0 mL·min－1;進樣量:40μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI);負離子電離模式;多反應監(jiān)測;撞氣壓力:8 psi(1 psi=6.895 kPa);氣簾氣壓力:25 psi;源內氣體1壓力:70 psi，氣體2壓力: 60 psi;電噴霧電壓:－4 500 V;離子源溫度:750℃。檢測離子:福辛普利拉離子(m/z:434.2→236.9)，去簇電壓:－70 V，碰撞能量:－29 V;內標離子(m/z:369.0→169.9)，去簇電壓:－55 V，碰撞能量:－27 V。

2.3 血漿樣本處理及測定

精密吸取血漿樣本200μL至1.5 mL塑料離心管中，加入內標工作液(1.000 mg·L－1，用甲醇配制)50μL，渦旋混勻，加入甲醇500μL，渦旋1min，沉淀蛋白，于4℃、16 000 r·min－1離心10 min，精密吸取上清液100μL至進樣瓶中，加入水相100μL，渦旋混勻，進樣，進行LC-MS/MS分析。

2.4 臨床試驗方案

20名中國健康男性志愿者，體重(64.9±6.8)kg，身高(172.9±5.6)cm，年齡(24±2)歲，經體檢合格后參加試驗，并簽署知情同意書。本試驗方案經蘇州大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批通過。受試者在試驗前2周及試驗期間未服用其他任何藥物，試驗期間統(tǒng)一飲食。受試者服藥前一天禁食過夜(約10 h)，試驗開始當天早晨空腹口服福辛普利鈉片10 mg，于服藥前和服藥后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、24.0、36.0、48.0 h由肘靜脈取血樣3 mL置肝素化離心試管中，混勻，4 000 r·min－1離心5 min，分離所得血漿于－30℃冷凍保存待測。采用DAS2.0軟件處理血藥濃度－時間數據，計算藥動學參數。

3 結果

3.1 方法學評價

3.1.1 專屬性 分別吸取空白血漿、加入福辛普利拉對照品和內標的空白血漿以及加入內標的受試者服藥后血漿樣本，按“2.3”項下方法處理并進樣，記錄色譜圖(見圖1)。

圖1 LC-MS/MS專屬性試驗色譜圖Figure 1 Chromatograms of LC-MS/MS specificity test

由圖1可見，福辛普利拉和內標的保留時間分別約為3.5和2.6 min，且峰形良好，血漿樣本測定無雜質干擾。

3.1.2 標準曲線及最低定量限 精密吸取20μL不同質量濃度的福辛普利拉標準溶液(以甲醇為溶劑，用福辛普利拉對照品配制)至1.5 mL塑料離心管中，以氮氣吹干，精密加入200μL空白血漿，渦旋混勻，配制成福辛普利拉質量濃度分別為0.500 5、1.502、5.005、15.02、50.05、150.2、300.3μg·L－1的標準含藥血漿，按“2.3”項下方法處理并進樣，記錄色譜圖。以福辛普利拉峰面積(As)和內標峰面積(Ai)的比值f(As/Ai)對福辛普利拉血藥濃度(C)進行權重回歸，得回歸方程:f= 0.006 17×C+0.000 389，r=999 9，權重系數為1/C2。結果表明，福辛普利拉血藥濃度在0.500 5～300.3μg·L－1范圍內線性關系良好，最低定量限為0.5μg·L－1(RSD=5.3%，n=6)。

3.1.3 精密度和準確度 按“3.1.2”項下方法制備福辛普利拉質量濃度分別為 1.201、24.02、240.2μg·L－1的標準含藥血漿，每個濃度平行5份，按“2.3”項下方法處理并測定，每天1批，連續(xù)測定3批，同時制備隨行標準曲線。用excel軟件對所測數據進行單因素方差分析，計算批內和批間精密度(RSD)以及準確度［相對偏差(RE)］，結果顯示方法精密度和準確度良好(見表1)。

表1 血漿中福辛普利拉檢測的精密度和準確度試驗結果(±s，n=15)Table1 Result of precision and accuracy test for fosinoprilat in human plasma

表1 血漿中福辛普利拉檢測的精密度和準確度試驗結果(±s，n=15)Table1 Result of precision and accuracy test for fosinoprilat in human plasma

加入量/ __μg·L－1測得量/ μg·L－1批內RSD/ %批間RSD/ % RE/ % 1.201 1.188±0.041 3.6 2.2 －1.1 24.02 23.47±0.67 1.6 6.4 －2.3 __240.2_____224.7±12.5______________________________ 2.713.2_－6.5

3.1.4 提取回收率 按“3.1.2”項下方法制備福辛普利拉質量濃度分別為1.201、24.02、240.2 μg·L－1的標準含藥血漿，并按“2.3”項下方法處理;另取空白血漿200μL至1.5 mL塑料離心管中，共3份，均加入甲醇500μL，渦旋1 min，于4℃、16 000 r·min－1離心10 min，取盡上清液，并在上清液中加入福辛普利拉對照品和內標，使溶解，渦旋混勻，分別制得同上3個質量濃度的福辛普利拉+內標溶液，精密吸取100μL至進樣瓶中，加入100μL水相，混勻。以上兩種方法制得并處理的樣液每個濃度平行6份，分別進樣測定，以兩種方法所獲同濃度樣液的峰面積比值計算提取回收率。結果測得，血漿中低、中、高3個質量濃度的福辛普利拉的提取回收率分別為(96.0± 5.7)%、(89.3±2.6)%和(89.4±2.3)%，內標的提取回收率為(92.3±3.0)%。

3.1.5 基質效應 精密吸取6個不同來源的空白血漿各200μL分別至1.5 mL塑料離心管中，均加入甲醇500μL，渦旋1 min，于4℃、16 000 r·min－1離心10 min，取上清液600μL作為血漿基質;另取去離子水200μL至1.5 mL塑料離心管中，同法處理得對照基質。分別取血漿基質和對照基質，均加入福辛普利拉對照品和內標，使溶解，渦旋混勻，制得同上3個質量濃度的福辛普利拉+內標樣液，精密吸取100μL至進樣瓶中，加入100μL水相，混勻。以上兩種樣液每個濃度平行6份，分別進樣測定，以同濃度的兩種樣液的峰面積比值計算基質效應。結果測得，血漿中低、中、高3個質量濃度的福辛普利拉的基質效應分別為(93.0± 5.0)%、(93.1±9.7)%和(94.0±8.7)%，內標的基質效應為(93.7±5.2)%。

3.1.6 穩(wěn)定性 按“3.1.2”項下方法制備福辛普利拉質量濃度分別為1.201、24.02、240.2μg·L－1的標準含藥血漿，分別于室溫放置4 h、－30℃反復凍融3次及－30℃保存至19 d，再按“2.3”項下方法處理并進樣測定，或將處理后的含藥血漿樣本(即上清液)在自動進樣器于8℃放置15 h或福辛普利拉標準溶液于－40℃冷凍15 d后再進樣測定。結果測得經以上不同處置的各樣本中福辛普利拉含量均無明顯變化，表明福辛普利拉的甲醇溶液及血漿樣本穩(wěn)定性良好。

3.2 藥動學評價

按“2.4”項下方案，20名健康受試者口服福辛普利鈉片后，在各時間點采集血樣，分離血漿，再按“2.3”項下方法處理并進樣，測得福辛普利拉血藥濃度，繪制平均血藥濃度－時間曲線(見圖2);且發(fā)現福辛普利拉在體內的經時過程符合二房室模型，其主要藥動學參數與文獻報道［3，5］基本一致:Cmax為(148.4±43.9)μg·L－1，Tmax為(4.05±0.76)h，AUC0-48h為(1 315±342)μg·h·L－1，AUC0-∞為(1 335±341)μg·h·L－1，CL/F(清除率)為(7.957± 1.969)L·h－1，Vd(表觀分布容積)為(103.9± 41.2)L，t1/2為(8.94±2.62)h。

圖2 福辛普利拉的平均血藥濃度－時間曲線(±s，n=20)Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of fosinoprilat

4 討論

福辛普利拉結構中含有次磷酸基、氨基和羧基，因此流動相的pH值對其色譜行為至關重要。色譜試驗發(fā)現，當水相pH小于7時，福辛普利拉吸附在色譜系統(tǒng)中，甚至無法洗脫;當水相pH大于7而小于10時，福辛普利拉峰形差，靈敏度低，重現性差;而當水相pH大于10時，福辛普利拉可獲得較好的色譜峰形，并可使次磷酸基和羧基充分解離，避免氨基帶正電荷，有利于負離子的生成，提高響應。但采用pH大于10的純水相系統(tǒng)時，福辛普利拉在色譜柱上幾乎無保留，因此需向水相中添加醋酸銨，以增加其在色譜柱上的保留，從而有利于其與血漿中內源性雜質分離，減小基質效應，同時醋酸銨可與氨水形成緩沖鹽，保持色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。由于只有在極端的堿性條件下才能避免ESI離子源的不銹鋼表面對磷酸鹽化合物的吸附［6］，因此本文選用了WATERSXTerra?RP18色譜柱，從而保證色譜系統(tǒng)在pH1～12范圍內的穩(wěn)定性和耐用性，且該色譜柱具有內嵌極性基團的固定相，分析時可在固定相的表面形成水層，而水屏蔽層能夠掩蔽解離后帶負電的硅羥基，可有效阻止含氮化合物與硅膠表面殘留硅羥基間的作用，減少拖尾現象發(fā)生［7］。

基質是指生物樣本中除待分析物以外的一切組成，包括蛋白、磷脂及其他內源性物質。本實驗中，由于對血漿樣本的處理采用了蛋白直接沉淀法，因此在基質效應試驗中，不同于一般液－液提取法所采用的流動相溶解對照品或提取揮干的血漿樣本殘渣的方法，而是將去離子水和空白血漿以相同的處理方法制備對照基質和血漿基質，然后分別加入福辛普利拉對照品和內標，再以水相配成近似于流動相的溶樣環(huán)境后進樣分析。這是因為，如果直接用流動相溶解對照樣本，則與擬定的樣本處理后的進樣條件有所不同，而樣本所處的溶樣環(huán)境不同可能引起響應的差異，進而導致測定誤差。本文基質效應試驗的最后一步“精密吸取100μL該溶液至進樣瓶中，加入100μL水相，混勻，進樣”即是為了保證同時將血漿基質樣本和對照樣本配成近似于流動相的溶樣環(huán)境，而又與擬定的樣本處理方法相同。

本文建立的分析方法簡便、準確、靈敏，適用于福辛普利鈉片的臨床藥動學研究。

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