黃 芳，章金明，酈衛(wèi)弟，呂要斌

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)和微生物研究所，浙江 杭州 310021)

小菜蛾P(guān)lutella xylostella L.屬鱗翅目Lepidoptera菜蛾科Plutellidae，最早發(fā)源于地中海地區(qū)，危害含有芥子油及其葡糖苷的十字花科植物，寄主多達(dá)40種以上，是十字花科蔬菜的主要害蟲之一。Waterhouse［1］將其定義為太平洋地區(qū)十字花科蔬菜中為害等級最高的害蟲。近年來小菜蛾發(fā)生范圍越來越大，頻率越來越高。小菜蛾環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)，對眾多化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了很高的抗性［2］。研究認(rèn)為，一些解毒酶，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、多功能氧化酶 (MFOs)、羧酸酯酶 (CE)和乙酰膽堿酯酶 (AchE)等，其活性的改變可反應(yīng)昆蟲體內(nèi)對諸多化學(xué)藥劑的變化［3］。

生物因子在控制小菜蛾種群數(shù)量方面起著十分重要的作用，小菜蛾在生長發(fā)育的各階段均會遭到寄生性及捕食性天敵的襲擊。經(jīng)過長期室內(nèi)及田間實驗總結(jié)證明，半閉彎尾姬蜂 Diadegma semiclausum在控制小菜蛾種群方面具有十分重要的地位［4］。早在1938年，半閉彎尾姬蜂就已經(jīng)作為從境外引入的天敵用于控制當(dāng)?shù)匦〔硕?，引入后其控害作用一直十分有效，并且在其他國家也進(jìn)行了成功應(yīng)用，如澳大利亞、印度尼西亞、中國臺灣等，現(xiàn)如今已成為小菜蛾綜合防治管理中的一個重要環(huán)節(jié)［5］。

隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，田間生物防治在整個綜合防治體系中所占比例越來越大，但化學(xué)藥劑仍然有其存在的必要性和不可替代性。目前，針對昆蟲—化學(xué)藥劑—天敵這一體系已經(jīng)開展了大量的工作，其中大部分報道集中于天敵捕食或寄生經(jīng)施藥處理的昆蟲后的死亡率及相關(guān)的生理生化變化［6］。然而，針對被天敵寄生后的寄主的抗藥性卻鮮有報道。

因此，為了更加科學(xué)地指導(dǎo)田間合理用藥，本文通過以小菜蛾—半閉彎尾姬蜂系統(tǒng)為研究對象，檢測半閉彎尾姬蜂寄生后不同齡期寄主小菜蛾幼蟲體內(nèi)解毒酶系的活性變化，明確寄生對小菜蛾幼蟲抗藥性的影響，以期為小菜蛾的綜合生物化學(xué)防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)

小菜蛾在控光 (L14:D10，光照強(qiáng)度＞1 000 lx)、控溫 (22±1)℃、控濕 (相對濕度60% ～80%)的養(yǎng)蟲室或智能人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)。將一養(yǎng)蟲籠固定為產(chǎn)卵籠，收集小菜蛾蛹于此籠內(nèi)，待羽化后供給成蛾20%的蜂蜜水和清水;把一片甘藍(lán)葉套在扎有許多針孔的保鮮袋內(nèi)，插入一盛滿水的細(xì)口瓶中，放入產(chǎn)卵籠中;待小菜蛾產(chǎn)卵于保鮮袋上后，取下保鮮袋置于4℃冰箱短期保存?zhèn)溆没蛑苯右平拥脚柙缘母仕{(lán)上飼養(yǎng)，取適齡幼蟲用于實驗。

將網(wǎng)掃的成蜂、蜂繭和寄生的小菜蛾幼蟲從野外采回作為蜂源，在控光、控溫、控濕的人工氣候室內(nèi)進(jìn)行繁殖及續(xù)代:將帶有約300多頭2齡末至3齡初的小菜蛾幼蟲的盆栽甘藍(lán)置于養(yǎng)蟲籠內(nèi)，吸取保蜂盒中已羽化2 d的健壯雌雄蜂各20頭，放入養(yǎng)蟲籠內(nèi)，供給10%的蜂蜜水，任其自由交配并產(chǎn)卵寄生72 h后，移走成蜂，繼續(xù)飼養(yǎng)小菜蛾幼蟲，并陸續(xù)挑出未寄生已化蛹的小菜蛾蛹防止化蛾產(chǎn)卵(寄生的小菜蛾比未寄生的發(fā)育時間長)，直至幼蜂結(jié)繭，收集蜂繭于保蜂盒中待其羽化。

1.2 供試?yán)ハx的選取

小菜蛾2齡幼蟲大小及生理狀態(tài)具有高度的一致性，因此為保證實驗中處理與對照的可比性，供實驗用蟲均采用剛進(jìn)入3齡的幼蟲，即先挑取2齡末幼蟲，待其蛻皮后用于寄生。

為確保單次成功寄生，寄生方法如下:在1支長8 cm、直徑1.5 cm的小試管內(nèi)引入羽化2 d已交配過的雌蜂1頭，然后用毛筆挑取小菜蛾幼蟲1頭放入管內(nèi)觀察，產(chǎn)卵行為發(fā)生1次后用毛筆移出幼蟲，換另1頭未寄生的幼蟲重復(fù)操作，控制每頭雌蜂寄生30頭左右。將寄生過的小菜蛾幼蟲接到事先準(zhǔn)備好的葉片或盆菜上飼養(yǎng)，用于實驗。

1.3 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)活性測定

GST酶活性測定參照 Chiang等［7］的方法:將10頭小菜蛾幼蟲放入 900μL含有 1 mmol·L-1PTU的磷酸緩沖液 (pH為6.8)中，在液氮中研磨后，4℃條件下3 000 g離心5 min后棄沉淀，將上清液在4℃條件下再8 500 g離心1 h，上清液即為待測酶液，直接測定或放置于-80℃保存。取待測酶液加入到反應(yīng)液中 (含0.8 mmol·L-1二硝基苯和0.8 mmol·L-1谷胱甘肽)，測定 D340值。

1.4 多功能氧化酶 (MFOs)活性測定

酶液制備:取3頭小菜蛾幼蟲在冰冷的PBS中漂洗后，加入300μL冰冷反應(yīng)緩沖液 (PBS:0.1 mol·L-1，pH 值 7.4，含 1 mmol·L-1苯基硫脲，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1苯基磺酰氟，0.1 mmol·L-1二硫蘇糖醇，10%甘油)于冰上勻漿，勻漿液于4℃條件下10 000 g離心15 min，上清即為粗酶液，直接測定或于-80℃保存。

參照Sang等［8］的方法略加以修改，以對硝基酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定多功能氧化物酶活力:取100μL粗提酶液，加入1μL的0.1 mol·L-1對硝基苯甲醚(4-Nitroanisole) (用丙酮配制)，于37℃下保溫5 min后，加入20μL的2.0 mmol·L-1還原型輔酶II(NADPH)，于37℃恒溫振搖10 min后，加入1 mol·L-1的鹽酸50μL終止反應(yīng);加500μL氯仿萃取，取 300μL氯仿層與 300μL NaOH溶液(0.5 mol·L-1)混合后，于20 min內(nèi)取NaOH層測定D405值的變化，用對硝基酚的生成量表示酶活力［μmol·L-1·mg-1· (10 min)-1］;用 20 μL PBS代替NADPH作為對照。

1.5 羧酸酯酶 (CE)活性測定

CE酶活性測定的方法參照 Asperen［9］的方法:將1頭小菜蛾幼蟲放入200μL Pipes-NaOH緩沖液(0.1 mol·L-1，pH值7.4)中研磨，4℃條件下15 000 g離心5 min，上清液作為待測酶液，直接測定或放置于-80℃保存;取20μL待測酶液加入到反應(yīng)液中 (含 0.3 mmol·L-1α-醋酸萘酯)(總體積300μL)，室溫孵育15 min后加入50μL染劑 (1%固藍(lán)鹽B和5%十二烷基硫酸鈉以體積比5∶2混合)測定 D595值。

1.6 乙酰膽堿酯酶 (AchE)活性測定

在冰冷的0.1 mol·L-1PBS中解剖獲得10頭小菜蛾幼蟲的大腦，清洗后置于50μL 0.1 mol·L-1MOPS緩沖液中冰浴勻漿;4℃條件下15 000 g離心勻漿液15 min，上清液即為待測酶液，直接測定或-80℃保存。

在MOPS緩沖液中分別加入碘化硫代乙酰膽堿、5-5’-二硫代雙-2-硝基苯甲酸和碳酸氫鈉使終濃度分別達(dá)到0.6，9.6和42 mmol·L-1，形成反應(yīng)液;取280μL反應(yīng)液25℃條件下溫育5 min，加入待測酶液20μL后再靜置30 min后測定D402值。用MOPS緩沖液代替酶液作為對照。

2 結(jié)果和分析

2.1 寄生對寄主GST活性的影響

如圖1所示，相對于未寄生的小菜蛾幼蟲，寄生后的小菜蛾幼蟲體內(nèi)GST活性顯著提高，且隨著寄生時間的延長這種差異逐漸加大，說明半閉彎尾姬蜂寄生能夠顯著影響寄主小菜蛾幼蟲的GST活性。

2.2 寄生對寄主CE活性的影響

如圖2所示，不論CE酶活性還是酶活力的變化趨勢，被寄生的小菜蛾與未被寄生的小菜蛾之間都不存在顯著差異。

2.3 寄生對寄主MFOs活性的影響

如圖3所示，除了3齡末幼蟲外，未被寄生的小菜蛾幼蟲MFOs活性與被半閉彎尾姬蜂寄生后的小菜蛾幼蟲的MFOs活性不存在顯著差異。而寄生后3齡末幼蟲的MFOs活性得到顯著提高。

圖1 半閉彎尾姬蜂寄生對寄主小菜蛾體內(nèi)GST活性的影響

圖2 半閉彎尾姬蜂寄生對寄主小菜蛾體內(nèi)CE活性的影響

圖3 半閉彎尾姬蜂寄生對寄主小菜蛾體內(nèi)MFOs活性的影響

2.4 寄生對寄主AchE活性的影響

如圖4所示，寄生后的小菜蛾幼蟲AchE活力較對照發(fā)生顯著變化。在整個發(fā)育過程中，半閉彎尾姬蜂寄生后小菜蛾幼蟲體內(nèi)的AchE活力變化并不顯著，然而相對于未寄生小菜蛾體內(nèi)AchE活性變化而言，被半閉彎尾姬蜂寄生后的小菜蛾體內(nèi)AchE的活性是受到抑制的。

圖4 半閉彎尾姬蜂寄生對寄主小菜蛾體內(nèi)AchE活性的影響

3 小結(jié)和討論

寄生蜂幼蜂能夠通過調(diào)節(jié)寄主代謝間接影響寄主對一些異源物譬如殺蟲劑等的抗性。Idris等［10］發(fā)現(xiàn)小菜蛾在被島彎尾姬蜂Diadegma insulare寄生后48 h后對殺蟲劑的敏感性相對于對照下降。Ibrahim等［11］也發(fā)現(xiàn)寄生后的寄主幼蟲體內(nèi)的解毒酶系活性明顯高于未被寄生的幼蟲。在本文研究結(jié)果中，半閉彎尾姬蜂寄生后的寄主GST活力顯著提高，部分寄主的MFOs活力提高，這一部分的結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致。唐振華等［12］證明 GST活性提高是小菜蛾抗性提高的一個重要機(jī)制。Takeda等［13］研究表明，菜蛾盤絨繭蜂寄生后小菜蛾幼蟲的相關(guān)解毒酶 (其中包括GST)活力得到顯著提高，這一事實進(jìn)一步證實了 Liu等［14］提出的菜蛾盤絨繭蜂的寄生能夠增強(qiáng)其寄主小菜蛾幼蟲對殺蟲劑抗性的觀點。因此，半閉彎尾姬蜂作為小菜蛾重要的幼蟲寄生蜂，其寄生后寄主的抗性同樣得到提高。Shelby等［15］證實索諾齒唇姬蜂的主要寄生因子之一——多分DNA病毒 (PDVs)能夠提高煙芽夜蛾幼蟲體內(nèi)GST的表達(dá)水平;此后，Kroemer等［16］也做出了相同的結(jié)論。半閉彎尾姬蜂的主要寄生因子中也含有PDVs［17］。由此推斷，半閉彎尾姬蜂寄生后寄主幼蟲GST活性的提高與抗性的增強(qiáng)可能與PDVs有關(guān)。

在Takeda等［13］的研究結(jié)果中，菜蛾盤絨繭蜂寄生后的寄主小菜蛾幼蟲的AchE的活力也顯著提高;但本文的研究結(jié)果恰恰與之相反。AchE是有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑最重要的靶標(biāo)物質(zhì)［18］。有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類等殺蟲劑主要通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中AchE對神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿Ach的水解作用，干擾和最終阻斷突觸傳導(dǎo)而發(fā)揮它們的毒效。在乙酰膽堿酯酶所介導(dǎo)的抗性機(jī)理研究中，AchE活性增加、AchE量的增加都可能與昆蟲抗性水平成正比［19］。菜蛾盤絨繭蜂寄生后寄主幼蟲體內(nèi)的AchE顯著提高，說明寄生后寄主幼蟲對有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的抗性也相應(yīng)提高［13］;據(jù)此，半閉彎尾姬蜂寄生后寄主幼蟲AchE活力顯著下降，可能意味著寄生后寄主幼蟲對有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的抗性降低。這一現(xiàn)象與其他寄主—寄生蜂系統(tǒng)的研究結(jié)果存在差異，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

半閉彎尾姬蜂寄生對寄主小菜蛾幼蟲的免疫系統(tǒng)有顯著的抑制作用［20］，然而半閉彎尾姬蜂作為一種容性的內(nèi)寄生蜂，在一段相當(dāng)長的時間內(nèi)會和寄主保持一種共生關(guān)系。通過本文實驗證明，被半閉彎尾姬蜂寄生后寄主幼蟲的部分抗藥性得到增強(qiáng)，可以被認(rèn)為是對寄主被削弱的免疫系統(tǒng)的一種補(bǔ)償?？偟脕碚f，在野外天敵種群數(shù)量較大的情況下，如果不恰當(dāng)?shù)厥褂没瘜W(xué)殺蟲劑，不僅僅會影響天敵的田間種群，可能還會降低化學(xué)藥劑的控害效果。

［1］ Waterhouse D F.Biological control of diamondback moth in the Pacific［G］ //Talekar N S.Proceedings Second International Workshop，Management of diamondback moth and other crucifer pests.Taiwan:AVRDC，1992:213-222.

［2］ 沈福英.小菜蛾抗藥性治理及研究進(jìn)展 ［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，14(8):58-60.

［3］ Wilson T G.Resistance of Drosophila to toxins［J］ .Annu Rev of Entomol，2001，46:545-571.

［4］ Huang F，Cao T T，Shi M，et al.Parasitism-induced effects on host growth and metabolic efficiency in Plutella xylostella larvae parasitized by Cotesia vestalis or Diadegma semiclausum ［J］ .Insect Sci，2008，15:237-243.

［5］ Lavandero B，Wratten S，Shishehbor P，et al.Enhancing the effectiveness of the parasitoid Diadegma semiclausum(Hellen):Movement after use of nectar in the field ［J］ .Biol Control，2005，34:152-158.

［6］ 吳剛，江樹人.寄生蜂抗藥性研究進(jìn)展 ［J］.昆蟲學(xué)報，2004，47(4):515-521.

［7］ Chiang F M，Sun C N.Glutathione transferase isozymes of diamondback moth larvae and their role in degradation of some organophosphorus insecticides ［J］ .Pestic Biochem Physiol，1993，45:7-14.

［8］ Sang C，Soderlund D M.Monooxygenase activity of tobacco budworm(Heliothis virescenes H.)larvae:tissue distribution and optimal assay conditions for the gut activity［J］ .Comp Biochem Physiol，1984，79B:407-411.

［9］ Van Asperen K.A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method［J］ .J Insect Physiol，1962，8:401-416.

［10］ Idris A B，Grafius E.Pesticides affect immature stages of Diadegma insulare(Hymenoptera:Ichneumonidae)and its host，the diamondback moth(Lepidoptera:Plutellidae)［J］ .J Econ Entomol，1993，86:1203-1212.

［11］ Ibrahim S A，Ottea J A.Biochemical and toxicological studies with laboratory and field populations of Heliothis virescens(F.)［J］ .Pestic Biochem Physiol，1995，53:116-128.

［12］ 唐振華，周成理，吳世昌.上海地區(qū)小菜蛾的抗藥性及增效劑的作用 ［J］.植物保護(hù)學(xué)報，1992，19(2):179-185.

［13］ Takeda T，Nakamatsu Y，Tanaka T.Parasitization by Cotesia plutellae enhances detoxifying enzyme activity in Plutella xylostella［J］ .Pestic Biochem Physiol，2006，86:15-22.

［14］ Liu S S，Li Y X，Tang Z H.Host resistance to an insecticide favors selection of resistance in the parasitoid，Cotesisa plutellae(Hymenoptera:Braconidae)［J］ .Biol Control，2003，28:137-143.

［15］ Shelby K S， Webb B A.Polydnavirus infection inhibits translation of specific growth-associated host proteins ［J］ .Insect Bioch Mol Biol，1997，27:263-270.

［16］ Kroemer J A，Webb B A.Polydnavirus genes and genomes:emerging gene families and new insights into polydnavirus replication［J］ .Annu Rev Entomol，2004，49:431-456.

［17］ Huang F，Shi M，Chen Y F，et al.Oogenesis of Diadegma semiclausum(Hymenoptera:Ichneumonidae)and its associated polydnavirus［J］ .Microsc Res Tech，2008b，71:676-683.

［18］ Taylor J L， Mayer R T， Himel C M.Acetylcholinesterase inhibition via a series of polyacene probe molecules:an example of integrated probe management techniques［J］ .Anal Spectrosc Lib，1995，6:281-311.

［19］ 唐振華，畢強(qiáng)，馮鎮(zhèn)泰.從乙酰膽堿酯酶的結(jié)構(gòu)與功能論有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的研發(fā) ［J］.新農(nóng)藥，2002(5):33-37.

［20］ Huang F，Shi M，Li J Y，et al.Changes in hemocytes of Plutella xylostella after parasitism by Diadegma semiclausum［J］ .Arch Insect Biochem Physiol，2009，70:177-187.