李玉莉，陳曉峰，韓 雪，苗國厚，胡 慶，雷 波(1.華南理工大學材料科學與工程學院，廣東廣州510640)

(2.國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006)(3.廣東省生物醫(yī)學工程重點實驗室，廣東廣州510006)

微納米生物玻璃的體外成骨性能研究

李玉莉1，2，3，陳曉峰1，2，3，韓 雪1，2，3，苗國厚1，2，3，胡 慶1，2，3，雷 波1，2，3(1.華南理工大學材料科學與工程學院，廣東廣州510640)

(2.國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006)(3.廣東省生物醫(yī)學工程重點實驗室，廣東廣州510006)

微納米生物活性玻璃因其具有特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化性能目前引起眾多研究者的關(guān)注，但是目前對微納米生物活性玻璃的結(jié)構(gòu)及形態(tài)對細胞性能的影響研究的較少。本文通過溶膠－凝膠法結(jié)合模板仿生技術(shù)合成了具有特殊結(jié)構(gòu)和形態(tài)的微納米生物活性玻璃，并通過體外細胞實驗，研究了這種微納米結(jié)構(gòu)對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨性能(ALP，Runx2，Col1a1和OPN)的影響，結(jié)果證明具有規(guī)則形態(tài)的生物活性玻璃(SBG)相比不規(guī)則形態(tài)的生物活性玻璃(IBG)更能促進細胞的體外成骨性能，為將來設計具有特定結(jié)構(gòu)的生物活性玻璃提供了參考依據(jù)。

微納米生物玻璃;溶膠－凝膠技術(shù);堿性磷酸酶;成骨基因

1 前言

由美國佛羅里達大學Larry L.Hench教授于20世紀70年代初研制的生物活性玻璃(Bio-Active Glass)是無機類生物活性材料的一個重要組成部分［1］。其與之前的生物材料的最大的區(qū)別，是可以與骨組織形成鍵合。由于其具有良好的生物活性，能夠與骨形成牢固的化學結(jié)合，一問世便引起國際生物材料學界的高度關(guān)注。經(jīng)過10多年的研究，在1985獲得FDA批準進入臨床［2］，并引發(fā)了生物活性玻璃研究的熱潮。目前，對生物玻璃的結(jié)構(gòu)、理化及生物學性能研究仍在不斷深入，特別是近年來，在生物玻璃的細胞學研究方面取得一些突破性進展，證明生物玻璃具有一定的細胞和基因激活作用，這對于骨組織的再生修復是一個關(guān)鍵因素［3－5］。溶膠 －凝膠法是一種新興的技術(shù)，在20世紀90年代才被引用到生物玻璃的制備過程中來［6］。由于溶膠－凝膠技術(shù)室溫可控，后續(xù)的熱處理溫度在600～700℃，在工藝上易于操作。并且，制備的生物玻璃具有多孔結(jié)構(gòu)、密度小、比表面積高，生物活性高，在保持生物活性的前提下，其化學組成可在較大范圍內(nèi)進行調(diào)整，是一種非常有前途的制備方法。進入21世紀后，隨著納米時代的到來，為了進一步改善生物活性材料的組織修復特性，近年來對生物活性材料的納米化，引起國內(nèi)外生物醫(yī)學材料學界的廣泛重視。但由于微納米生物玻璃與傳統(tǒng)的生物玻璃45S5和溶膠－凝膠生物玻璃58S、77S和70S30C等，在形態(tài)上存在很大的區(qū)別，因此，單純從生物玻璃溶出離子角度很難評價微納米生物活性玻璃的形態(tài)對細胞學行為的影響。

本文采用溶膠－凝膠技術(shù)結(jié)合有機模板法，制備了一種具有規(guī)則形態(tài)的微納米生物活性玻璃，并通過體外實驗研究了這種形態(tài)的生物活性玻璃對細胞行為的影響，考察了其對成骨基因表達的影響。

2 材料與方法

2.1 生物玻璃的制備與表征

以生物活性良好的化學組分為60%SiO2，36%CaO，4%P2O5(摩爾百分數(shù))的溶膠－凝膠生物玻璃(58S)為研究對象。制備微球顆粒形態(tài)的60S生物玻璃工藝過程主要分為以下幾步:將一定量的檸檬酸(CA)溶解于無水乙醇的水溶液中，磁力攪拌10 min，形成溶液A;將一定量的前驅(qū)體原料正硅酸乙脂(TEOS)、磷酸三乙脂(TEP)、四水硝酸鈣按順序加至溶液A中，形成溶膠B;將一定量的聚乙二醇(PEG-6000，PEG-10000)加入到溶膠B中并繼續(xù)攪拌 4 h，以使生物玻璃的前驅(qū)體充分水解以及PEG分子的成形組裝;將充分水解的溶膠B裝入密封的50 ml塑料離心管中，于60℃水熱老化24 h;將塑料管中的濕凝膠取出于60℃干燥24 h;將烘干好的干凝膠研磨后，置入高溫爐中以10℃/min升至600℃熱處理2 h，研磨無需過篩即可得到分散良好的生物活性玻璃微球顆粒。

樣品的微納米結(jié)構(gòu)形貌采用日本JSM6330F高分辨場發(fā)射掃描電鏡進行觀察。

2.2 人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離

人骨髓間充質(zhì)干細胞(HMSCs)取自非造血系統(tǒng)、非遺傳性疾病且未累及骨髓的正常成人骨髓，將原代細胞置于低糖培養(yǎng)基(L-DMEM，GIBCO)中，在37℃、體積分數(shù)5%的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。細胞貼壁并匯合成單層后，按1∶3傳代進行擴增。傳至第3代，消化離心以 1×105個/cm2密度，分別在成骨誘導液、L-DMEM中，將兩種生物玻璃與細胞共培養(yǎng)，考察其成骨性能。

2.3 檢測項目與方法

2.3.1 堿性磷酸梅(ALP)活性檢測

蛋白提取細胞和生物玻璃在6孔板中培養(yǎng)6，10 d時，用冰冷的PBS洗兩次，加入300 μl ALP裂解液，轉(zhuǎn)移到EP管中，冰上裂解數(shù)分鐘。用超聲細胞破碎機超聲裂解。然后轉(zhuǎn)移到冰凍離心機中，13 000 rpm離心2 min，將上清液分裝，－80℃冰凍保存。

堿性磷酸酶(ALP)測定將200 μl濃度5 mmol/L的對硝基苯酚(p-Nitrophenol，BIO BASIC INC)加入到1.5 ml的EP管中，再將解凍的樣品吸取20 μl加入，37℃水浴15 min。再加入0.5 ml濃度0.1 mol/L的NaOH終止反應，用酶標儀讀取410 nm處的讀數(shù)。

BCA測定總蛋白按照BCA試劑盒(BCATM Protein Assay Kit，Thermo)的說明，吸取每一份待測液25 μl注入96孔板中，加200 μl的BCA工作液到每一個孔中，在搖床上搖晃30 s使液體充分的混勻，再蓋上孔板37℃孵化30 min。結(jié)束后將孔板取出，冷卻至室溫，用酶標儀測量562 nm處的吸光度。

堿性磷酸酶(ALP)活性等于ALP測定的觀測值與總蛋白測定的觀測值之比。

2.3.2 成骨基因檢測

RNA的提取將與材料復合培養(yǎng)5 d的細胞抽提RNA。每孔加入 1 ml Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)反復吹打，按照說明書上的步驟抽提RNA，將干燥后的 RNA溶于20 μl的 DEPC水中，在 NanoDrop2000(Thermo Scientific)上檢測RNA濃度，并立即進行逆轉(zhuǎn)錄。

RNA的逆轉(zhuǎn)錄取500 ng總RAN，采用Fermentas Life Sciences公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，在PCR儀(TC-412，TECHNE公司)上進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄完成后，cDNA立即進行Real-time PCR(qRT-PCR)。

Real-time PCR(qRT-PCR)檢測采用TaKaRa公司的SYBR Premix EX Taq在實時定量 PCR儀(Chromo4，BIO-RAD公司)上進行 Real-time PCR(qRT-PCR)檢測，引物序列見表1。

表1 成骨相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences of correlative genes for osteogen

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS Version 18.0對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，其中組間比較采用One-Way ANOVA法分析，方差齊時采用S-N-K法分析統(tǒng)計顯著性水平為P＜0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 生物活性玻璃微球制備技術(shù)對微球形貌的影響

實驗前期研究了酸催化溶膠－凝膠技術(shù)結(jié)合PEG作模板劑制備微納米生物活性玻璃的過程中，PEG分子量對微納米生物活性玻璃的形貌和尺寸的影響［7］。研究發(fā)現(xiàn)，PEG6000制備得到直徑為5 μm左右的規(guī)則的微米球，球體表面有明顯的微納米裂紋(SBG，圖1a，b);當使用PEG10000制備時，合成了不規(guī)則的納米生物活性玻璃顆粒，尺寸在70～200 nm之間，顆粒之間有輕微團聚(IBG，圖1c，d)。

圖1 生物活性玻璃微球的SEM照片:(a，b)SBG，(c，d)IBGFig.1 SEM micrographs of bioactive glasses:(a，b)SBG and(c，d)IBG

3.2 SBS和IBS生物活性玻璃微球?qū)MSCs成骨性能影響的比較

堿性磷酸酶(ALP)在成骨誘導初期由成骨細胞分泌，是骨前體細胞成骨分化的標志之一［8］，常用堿性磷酸酶活性來定量表達骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的水平。從圖2可以看出，6 d和10 d時成骨誘導下SBG和IBG的ALP的表達水平比對照組都要高，且具有顯著性統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，成骨誘導環(huán)境中SBG的ALP表達均值在6 d和10 d時比IBG組要高，但是不具有統(tǒng)計學差異。在非成骨誘導環(huán)境下，SBG在10 d時ALP表達水平比IBG高。因此，SBG顯示出比IBG更好的ALP表達的情況。

3.3 成骨基因表達

Ι型膠原(COL1a1)由骨細胞生產(chǎn)的骨基質(zhì)中的主要有機成分［9－12］; 骨橋蛋白(OPN)是骨細胞通過它們的αVβ3 整合素錨釘?shù)降V化的骨表面［9－10，13］; 成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)是骨生成的“主導基因”，敲除Runx2的老鼠不能成骨(只形成軟骨的骨架，但是缺乏礦化的組織)［9，14－15］。

實驗通過實時定量PCR(qRT-PCR)的方法，測定相關(guān)成骨基因表達，同樣通過持家基因GAPDH對相關(guān)基因進行均一化，圖3是誘導培養(yǎng)5 d后，HMSCs在4種生物活性玻璃上相關(guān)成骨基因表達的情況。HMSCs分別在成骨誘導液和普通完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件下，Runx2、OPN和COL1a1這3個與成骨相關(guān)的基因的表達量，成骨誘導組要明顯高于對照組的。兩種生物玻璃的成骨誘導組和成骨對照組，Runx2這個促使積極分裂的成骨前體細胞轉(zhuǎn)向分化的相關(guān)基因已經(jīng)高表達，而且成骨誘導組高于對照組，表明兩種生物玻璃在外環(huán)境下培養(yǎng)5 d，HMSCs在兩種培養(yǎng)條件下，特別是在成骨誘導的條件下，生物玻璃上的細胞已經(jīng)從G1期走向G0期，退出了細胞周期，從有絲分裂轉(zhuǎn)向細胞分化，并通過激活骨細胞表型基因，促進成骨細胞分化和成熟。其中在成骨誘導環(huán)境下，SBG組明顯高于IBG組。

圖2 HMSCs在兩種生物玻璃微球誘導培養(yǎng)6 d和10 d后ALP表達的情況Fig.2 Alkaline phosphatase(ALP)activity of HMSCS seeded for 6 d and 10 d

從圖3可以看出，誘導組的OPN和COL1a1與骨細胞外基質(zhì)合成相關(guān)的基因表達量都發(fā)生上調(diào)，并且明顯可見，誘導組的上調(diào)量高于對照組的。其中，在誘導環(huán)境下SBG組的基因表達量又明顯高于IBG，尤其是OPN表達差異具有顯著性統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。從基因的相對表達量可見，與I型膠原合成相關(guān)的COL1a1基因作為細胞分化早期的標志物，其相對于其他基因有較高的表達量，標志著I型膠原這種骨組織的主要細胞外基質(zhì)逐步走向成熟。此外，其大量的合成和分泌還會為組織的礦化、鈣結(jié)節(jié)的形成提供基底，并對成骨細胞表型的分化起到加速的作用?？梢?，SBG在成骨誘導的條件下，已經(jīng)相對于其他實驗組和對照組，更早的進入了這種時期。

圖3 HMSCs誘導培養(yǎng)5 d后，成骨基因的表達Fig.3 Gene expression levels of osteogenic markers for cells seeded on SBG as measured at 5 d culture

基于近幾年的研究，Hench教授于2009年對生物玻璃的基因激活作用的機理提出了一個假說:從生物玻璃中溶出的離子，激活了細胞的基因朝著再生和自我修復的方向發(fā)展。生物玻璃中可溶性含水Si及Ca離子基團，溶出所形成的局部化學微環(huán)境，有利于激發(fā)內(nèi)皮祖細胞的成骨細胞進入細胞周期的活性階段(從G1期進入S期)［16］。因為Hench教授的理論主要是針對45S5提出的，所以更多的是注重溶出離子而沒有將生物玻璃的其他性能考慮在內(nèi)。Jell等［17］提出了另外一個更加全面的機制，同時考慮到生物玻璃溶出離子、表面化學以及拓撲結(jié)構(gòu)幾方面的影響，更加適合新型生物玻璃(圖4)。細胞不斷地通過自己的受體檢測其周圍環(huán)境中的細胞因子、趨化因子、機械應力、氣體和重要的生理離子等，細胞表面受體(如整合素)與細胞外基質(zhì)相互作用引起的細胞內(nèi)信號分子細胞級聯(lián)，最終通過級聯(lián)細胞轉(zhuǎn)錄因子(如成骨細胞核心結(jié)合因子Runx2)，啟動或關(guān)閉基因的表達，生物活性玻璃激活的基因(以前報告的是由生物玻璃45S5上調(diào)或下調(diào)基因)DNA解螺旋，轉(zhuǎn)錄成mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)(圖4)，這些蛋白質(zhì)決定了細胞表型，因此回應了最初的激活作用，也就是增殖、分化、基質(zhì)形成或細胞死亡的初始刺激的反應。

圖4 生物活性玻璃基因表達調(diào)控機制示意圖Fig.4 Gene expression regulation mechanisms by bioactive glasses

4 結(jié)論

生物玻璃可以通過形態(tài)來影響成骨基因的表達。具有規(guī)則球形的生物玻璃相比具有不規(guī)則納米結(jié)構(gòu)的生物玻璃，更能促進ALP的表達及成骨相關(guān)基因COL1a1、OPN和Runx2的表達，為我們將來設計生物玻璃的形態(tài)，提供了理論依據(jù)。

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Biocompatibility and Osteogenesis of Micro-and Nano-Bioactive Glasses

LI Yuli1，2，3，CHEN Xiaofeng1，2，3，HAN Xue1，2，3，MIAO Guohou1，2，3，HU Qing1，2，3，LEI Bo1，2，3
(1.School of Materials Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China)(2.National Engineering Research Center for Tissue Restoration and Reconstruction，Guangzhou 510006，China)(3.Guangdong Province Key Laboratory of Biomedical Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China)

Because of the special morphology and characterization，micro-and nano-bioactive glass caused much attention by researchers，but the morphology of micro-and nano-bioactive glass on cell performance has been underappreciated and underinvestigated.The special morphology of micro-and nano-bioactive glass was synthesized by the Sol-gel method combined with the template bionic.Human mesenchymal stem cells(hMSCs)were seeded on bioactive glass for 6 days and 10 days in vitro for alkalic phosphatase(ALP)activity and 5days for osteogenic gene expression analysis.Based on the results of ALP activity and osteogenic gene expression analysis，the responses of hMSCs to the SBG exhibited a higher degree of osteogenic differentiation than those on IBG in vitro.This work will provide a reference for design of specific morphology of the bioactive glass in the future.

micro-and nano-bioactive glass;Sol-gel method;alkaline phosphatase;osteogenic gene expression

R318.08

A

1674－3962(2012)06－0007－05

2012－04－11

國家自然科學基金資助項目(50830101，51072055，51172073);華南理工大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費資助項目，(2012ZP0001)

李玉莉，女，1979年生，博士

陳曉峰，男，1956年生，教授，博士生導師