黃守國(guó)，秦杰，陳瑾，程虹，蒙秋，張靜，王海燕

目前對(duì)腫瘤相關(guān)基因的研究已從腫瘤發(fā)生機(jī)制向轉(zhuǎn)移機(jī)制方向發(fā)展。某些原癌基因及抑癌基因不僅在腫瘤發(fā)生中起重要作用，且在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也有一定影響。癌基因的激活與抑癌基因的失活均可使細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)分裂和癌變。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是衡量其惡性程度的主要因素，是一個(gè)由多基因控制的、受多因素影響的、多階段多步驟的復(fù)雜過程，涉及癌細(xì)胞異常的增殖、黏附、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)降解及血管生成等一系列病理生理活動(dòng)。已有大量的試驗(yàn)證明腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與多種控制細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)失調(diào)相關(guān)［1-4］。為了解控制細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本中 N-myc、Fas、MTA1、nm23-H1基因的表達(dá)情況，并進(jìn)行對(duì)比分析，以期在基因水平探討子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的本質(zhì)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例標(biāo)本取自我院婦科2009年1月至2011年1月的住院患者，年齡25～65歲，平均年齡(47.38±12.35)歲。其中，非子宮內(nèi)膜癌患者正常子宮內(nèi)膜組織30例，子宮內(nèi)膜癌患者(均經(jīng)病理確診)子宮內(nèi)膜癌組織60例，根據(jù)術(shù)后病理檢查是否有子宮外轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組各30例，均取活體新鮮組織于－80℃冰箱保存?；颊呤中g(shù)前均未進(jìn)行化療、放療、生物治療等其他治療，排除其他系統(tǒng)合并癥及其他系統(tǒng)腫瘤等。

1.2 主要儀器與試劑 MJ OPTICON2型熒光PCR儀(BIO-RAD，美國(guó));Taq酶(TAKARA，日本);ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，日本);PCR擴(kuò)增引物:N-myc、Fas、MTA1、nm23-H1 及 β-actin 的mRNA由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，設(shè)計(jì)引物探針?biāo)密浖镻rimer express 2.0;常規(guī)的化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 引物探針 基因序列為，h β-actin forward:5'GGA TGC AGA AGG AGA TCA CTG 3';h β-actin probe:FAM-CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TCATTGTGC-BHQ1;h β-actin reverse:5'CGA TCC ACA CGG AGT ACT TG 3';h N-myc forward:5'CCA AGC CAG TTC CAT TAA AT3';h N-myc probe:FAMCAG GAG TCA GAT TCC AGG TTT ATG T-BHQ1;h N-myc reverse:5'GTC AGG AAT TTC AGT AAC ATT G3';h Fas forward:5'CAT CAT GAT GGC CAA TTC TGC C3';h Fas probe:FAM-CCT GTC CTC CAG GTG AAA GGA AAG C-BHQ1;h Fas reverse:5'TCT GGT TCA TCC CCA TTG ACT G3';h MTA1 forward:5'CCT ACC TGC CCA TCA ACA GCG C3';h MTA1 probe:FAM-CCA TCA AGG CCG AGT GCA CGG CGCBHQ1;h MTA1 reverse:5'TCA GCA CCA GCG GGC TCT G3';h nm23-H1 forward:5'TTT GAG CAG AAA GGA TTC C3';h nm23-H1 probe:FAM-TGT TGG TCT GAA ATT CAT GCA AGC TTC C-BHQ1;h nm23-H1 reverse:5'AAC GTA GTG TTC CTT GAG3。

1.4 人子宮內(nèi)膜(癌)組織總RNA的提取 (1)從超低溫冰箱中取出人子宮內(nèi)膜(癌)組織樣本，迅速剪下約0.25 g的樣品，置于預(yù)先加入200 μL RNAiso Plus的1.5 mL EP管中。(2)在 RNAiso Plus溶液中破碎人子宮內(nèi)膜(癌)組織，補(bǔ)充800 μL RNAiso Plus，混勻。在冰上靜置5min，再加入200 μL氯仿，蓋緊后劇烈振蕩15 s(氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開)。待溶液充分乳化后，在冰上靜置5min。(3)4℃，13 000 rpm高速離心樣品15 min后，將上層水相移至新管中，然后加入等體積的異丙醇，冰上放置10 min，4℃ ，13 000 rpm離心10 min。(4)棄上清液，用1 mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，來回顛倒數(shù)次后，以4℃，13 000rpm離心5min。(5)棄上清液，空氣干燥RNA 10 min，用 20 μL DEPC 水溶解，立即取 2 μL RNA做反轉(zhuǎn)錄，剩余18 μL－80℃凍存。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 抽提的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取2 μL RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)步驟為:(1)RNA 的熱變性，25 pmol/μL random primer 1 μL，RNase Free 水 9 μL，RNA 2 μL，總共12 μL，于 65℃水浴5 min后迅速在冰上冷卻2 min，簡(jiǎn)短離心收集反應(yīng)液。(2)反應(yīng)液配置，第一步變性后的RNA溶液 12 μL，5 × RT bμffer 4 μL，dNTP mixtμre(各 10 mmol)2μL，RNase Inhibitor(10 U/μL)1 μL，Rever Tra Ace 1μL。(3)反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.6 熒光定量PCR反應(yīng) 配制反應(yīng)體系共25 μL:10 PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol dNTP 2 μL，dH2O 16 μL，15 pmol/μL 引物(1+1) μL，15 pmol/μL 探針 0.3 μL，5U/μL Taq 0.2 μL，Template 2μL。PCR buffer成分:100 mM Tris-HCl(pH 值 8.3)，500 mM KCl，15 mM MgCl2。反應(yīng)過程:94℃ 2 min，94℃ 5 s，55℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。讀取FAM熒光數(shù)值，30℃5s。樣本同一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)基因統(tǒng)一上機(jī)，每個(gè)標(biāo)本分別做4個(gè)待檢測(cè)基因以及內(nèi)參β-actin的熒光定量PCR。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基因表達(dá)量采取隨機(jī)獨(dú)立樣本的方差分析及兩兩對(duì)比的LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 N-myc基因在各組標(biāo)本中表達(dá)量的比較 由表1可知，原癌基因N-myc在子宮內(nèi)膜癌未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(F=31.478，t= －6.049，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(F=44.770，t=－5.638，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組(F=40.643，t= －5.309，P=0.000)。

表1 N-myc基因在三組標(biāo)本中表達(dá)量的比較

2.2 Fas基因在各組標(biāo)本中表達(dá)量的比較 由表2可知，抑癌基因Fas在子宮內(nèi)膜癌未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(F=18.948，t=5.622，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(F=20.760，t=6.024，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)移組(F=11.335，t=4.979，P=0.001)。

表2 Fas基因在各組標(biāo)本中表達(dá)量的比較

2.3 MTA1基因在各組標(biāo)本中表達(dá)量的比較 由表3可知，腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因MTA1在子宮內(nèi)膜癌未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(F=38.203，t= －10.132，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(F=42.035，t= －5.881，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組(F=39.004，t=－5.488，P=0.000)。

表3 MTA1基因在各組標(biāo)本中表達(dá)量的比較

2.4 nm23-H1基因在各組標(biāo)本中表達(dá)量的比較

由表4可知，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1在子宮內(nèi)膜癌未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(F=16.644，t=6.181，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(F=18.431，t=6.815，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)移組(F=45.018，t=12.232，P=0.000)。

表4 nm23-H1基因在各組標(biāo)本中表達(dá)量的比較

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見婦科惡性腫瘤之一，是女性患者的主要死因之一。近年來子宮內(nèi)膜癌的防治已取得較大的進(jìn)展，使子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率明顯下降，但有關(guān)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的基因機(jī)制還未明確。因此，尋找子宮內(nèi)膜癌早期診斷的基因指標(biāo)及有效治療子宮內(nèi)膜癌的方法，進(jìn)一步明確子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)以及基因表達(dá)機(jī)制成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

凋亡是細(xì)胞區(qū)別于壞死的、主動(dòng)的、程序化的細(xì)胞死亡，是一系列凋亡促進(jìn)基因與抑制基因表達(dá)及相互作用造成細(xì)胞生存和死亡之間的選擇。N-myc基因作為一功能甚多的細(xì)胞凋亡抑制基因，通過表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。其在正常細(xì)胞中表達(dá)極低甚至不表達(dá)［5］。Fas是一種分子質(zhì)量為48ku的I型跨膜蛋白，屬于 TNF超家族。Fas配體(FasL)是一種分子質(zhì)量為40 ku的Ⅱ型跨膜蛋白，也屬于TNF超家族。Fas與FasL結(jié)合相互作用是引起細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞后激活淋巴細(xì)胞表達(dá)FasL，兩者特異性結(jié)合導(dǎo)致靶細(xì)胞內(nèi)源性自殺程序激活，細(xì)胞凋亡［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因N-myc在子宮內(nèi)膜癌組織轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量均高于正常子宮內(nèi)膜組織，且該基因在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組，由此說明，N-myc基因與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，即該基因促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的形成，對(duì)轉(zhuǎn)移亦有促進(jìn)作用，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。抑癌基因Fas在子宮內(nèi)膜癌組織轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量均低于正常子宮內(nèi)膜組織，且該基因在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)移組，由此說明，F(xiàn)as基因表達(dá)量降低與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生相關(guān)，與子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移亦相關(guān)。

腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤，通過各種轉(zhuǎn)移方式，到達(dá)繼發(fā)組織或器官后得以繼續(xù)增殖生長(zhǎng)，形成與原發(fā)腫瘤性質(zhì)相同的繼發(fā)腫瘤的全過程。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，提出了腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的全新理論，即基因調(diào)控下多元體系。腫瘤的轉(zhuǎn)移是癌基因與抑癌基因參與凋節(jié)的復(fù)雜過程，通過腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的過度表達(dá)，以及一系列基因產(chǎn)物的參與，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移全過程進(jìn)行調(diào)控。nm23基因是從K-1735鼠黑色素瘤細(xì)胞株中用消減雜交法分離出來的一種與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，即腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。人類nm23基因有兩個(gè)亞型即nm23-H1、nm23-H2。發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤與未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移者相比，nm23-H1的表達(dá)水平明顯降低，未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤的nm23-H1表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移者［7］。MTA1基因是從大鼠乳腺癌細(xì)胞系13762NF細(xì)胞中分離發(fā)現(xiàn)的，MTA1基因以共價(jià)修飾組蛋白、編碼轉(zhuǎn)錄因子、參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑、調(diào)節(jié)有關(guān)基因的表達(dá)等方式，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在MTA1過度表達(dá)的腫瘤一般均表現(xiàn)為深的漿膜層腫瘤浸潤(rùn)度、高的淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移率和顯著的血管腫瘤侵襲性［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因MTA1在子宮內(nèi)膜癌組織轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組，且該基因在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，由此說明，MTA1基因的過表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1在子宮內(nèi)膜癌組織轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中呈升表達(dá)，同時(shí)在子宮內(nèi)膜癌組與正常子宮內(nèi)膜組相比較中，該基因亦呈升表達(dá)趨勢(shì)，由此說明子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移及增殖與nm23-H1基因表達(dá)均成負(fù)相關(guān)。

總之，通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)基因體系可作為子宮內(nèi)膜癌早期診斷與監(jiān)測(cè)的基因指標(biāo)，亦可作為子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展及臨床治療的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，但其具體作用機(jī)制及臨床應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

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