馮 佳 袁 林 蘇林沖 向 陽 (湖北民族學院附屬民大醫(yī)院，恩施445000)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平降低，導致骨吸收大于骨形成，出現(xiàn)低骨量和骨組織顯微結(jié)構(gòu)退行性改變，以致骨脆性和骨折易感性增加的全身代謝性疾?。?］。在我國隨著老齡化社會的到來，骨質(zhì)疏松癥已成為危害公共健康最嚴重的問題之一。對骨質(zhì)疏松癥的預防性用藥是骨質(zhì)疏松癥防治領域研究的熱點之一，國外采用激素替代療法來預防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，但長期運用的安全性、可耐受性等問題限制其臨床應用，另一些藥物如降鈣素、二磷酸鹽等，雖對該癥療效明顯且副作用小，但價格昂貴，一般難以長期服用［2］。故研發(fā)療效可靠、作用全面、無明顯毒副作用、價格合理的預防藥物，是亟待解決的。“強骨康疏膠囊”是恩施州已故民間著名老中醫(yī)雷永恕治療骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗方。本實驗通過對去卵巢大鼠早期應用強骨康疏膠囊，探討該方對去卵巢大鼠骨密度、骨細微結(jié)構(gòu)及骨代謝影響的機制，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雌性SD 6月齡SPF級大白鼠50只，由武漢大學實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(鄂)2008-0004。

1.2實驗藥物 中藥強骨康疏膠囊(內(nèi)紅消、雞腸風、鐵打桿、見血飛、骨碎補、雞血藤、炒山藥、鹿角膠等)由湖北民族學院附屬民大醫(yī)院中藥房提供，將藥物制成湯劑，給藥劑量根據(jù)成人與動物體重劑量換算，按成人劑量2.4 g/kg/d，換算成大鼠的劑量為4.32 g/100 g/d，作為中藥低劑量，中藥高劑量為低劑量的2倍，按8.64 g/100 g體重給藥。戊酸雌二醇片，國藥準字J20080036，拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，使用時研磨以蒸餾水配成藥液，按0.03 mg/100 g體重灌胃。

1.3實驗儀器 雙能X掃描骨密度儀(Prodigy，美國)，自動脫水機(TC-120S)，切片機(RM2235，德國)，恒溫攤片烤片機(TK-218IV)，電熱恒溫干燥箱(GZX-DH-40X45)，熒光顯微鏡(BX50，日本)，彩色數(shù)碼照像系統(tǒng)(DP70，日本)。

1.4主要試劑 大鼠OPG和RANKL免疫組化一抗、兔IgG-SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5實驗方法

1.5.1大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立 SD雌性大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分出10只作為正常對照組，剩余40只制作骨質(zhì)疏松模型。以10%水合氯醛，按0.35 ml/100 g體重腹腔麻醉，待麻醉起效后，取俯臥位，于肋弓下脊柱兩側(cè)1 cm處，剪毛備皮，充分暴露手術(shù)視野，切開皮膚，逐層分離脂肪、肌肉，用眼科鑷小心提出腹腔脂肪，輕輕翻查，找到輸卵管后，順著輸卵管找到梅花狀的卵巢，剪去卵巢，結(jié)扎輸卵管后，將牽拉出的組織送回腹腔，分層縫合肌肉、皮膚。按同樣的方法去除大鼠雙側(cè)卵巢。術(shù)后，青霉素(80萬單位)肌肉注射0.1 ml/只。

1.5.2實驗動物分組及給藥 將未進行去卵巢手術(shù)的大鼠10只做為正常對照組，其余卵巢切除大鼠術(shù)后3天，將存活大鼠隨機分為4組，除去因灌胃死亡的大鼠數(shù)，各組分別為正常對照組9只、模型空白組8只、中藥低劑量預防組8只、中藥高劑量預防組8只、雌激素預防組8只。給中藥低劑量組、中藥高劑量組、雌激素組相應藥物，正常對照組、模型空白組給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥1個月。

1.5.3取材 處死前禁食12小時，稱重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，從髂嵴處取出雙側(cè)股骨，仔細剔除肌肉，左側(cè)股骨裹入浸透生理鹽水的紗布中編號，待做骨密度檢測;右側(cè)股骨放入10%甲醛中固定，編號。

1.5.4實驗指標的檢測 骨密度測定：取左側(cè)股骨，清除周圍軟組織，用生理鹽水沖洗干凈，用雙能X線骨密度測量儀測定各組大鼠股骨骨密度。

骨組織形態(tài)計量學參數(shù)測定：取大鼠右側(cè)股骨，制作脫鈣骨切片并染色，將HE染色的股骨組織切片置于顯微鏡下，彩色數(shù)碼照像系統(tǒng)進行圖像采集。用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)，對采集的圖像進行分析，選擇干骺板下5 mm作為測量指標范圍，每張切片選取10個視野，測量骨組織形態(tài)學參數(shù)骨小梁面積、骨小梁厚度及骨小梁間距，并計算骨小梁面積百分數(shù)，求各參數(shù)平均值。

OPG及RANKL蛋白表達的檢測：嚴格按照試劑盒說明書操作，將脫鈣骨石蠟切片放入二甲苯中脫蠟，然后雙氧水滅活內(nèi)源性酶，再進行熱修復抗原，滴加5%BSA封閉液封閉細胞，棄血清，分別滴加稀釋為1∶100的OPG及RANKL一抗(兔IgG)過夜，滴加生物素化羊抗兔二抗，滴加SABC試劑，DAB顯色后，蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。OB及MSC陽性反應細胞胞漿著色呈棕黃色，每個標本隨機選取5個視野，用 Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測定著色部位的平均光密度值，作為OPG及RANKL蛋白的表達強度。

1.6統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)由SPSS統(tǒng)計軟件處理，±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進行組間兩兩比較，用LSD檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1骨密度測量結(jié)果 與正常對照組相比，模型空白組大鼠股骨骨密度減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與模型空白組相比，雌激素預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組股骨骨密度差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);中藥低劑量組與雌激素預防組比較，骨密度有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);中藥高劑量組與中藥低劑量組相比，骨密度有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表1。

2.2HE染色觀察結(jié)果 骨組織HE染色光學顯微鏡下觀察顯示：正常對照組骨小梁排列密集，連續(xù)性好，成網(wǎng)狀連接，寬度均勻，相鄰骨小梁間距較小。模型組與正常組相比，骨小梁變細、數(shù)量減少，連續(xù)性破壞，游離斷端增多，骨小梁間距增大。雌激素預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組與模型空白組相比，骨小梁寬度增加，排列整齊，連續(xù)性較好，斷端減少，骨小梁間距減小，如圖1所示。

2.3骨組織形態(tài)計量學參數(shù)結(jié)果 與正常對照組比較，模型空白組骨小梁厚度、面積、面積百分數(shù)均減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，骨小梁間距增大，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型空白組比較，雌激素預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組的骨小梁厚度、面積、面積百分數(shù)均增大，骨小梁間距減小，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。中藥高劑量組與中藥低劑量組相比，各參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2、3。

表1 各組大鼠股骨雙能X線骨密度測定(±s)Tab．1 The measurement with BMD of femoral bone in each groups(±s)

表1 各組大鼠股骨雙能X線骨密度測定(±s)Tab．1 The measurement with BMD of femoral bone in each groups(±s)

Note：Compared with model blank group，1)P＜0.05，2)P＜0.01.

Groups n BMD(g/cm2)Normal control 9 0.141±0.0072)Model blank 8 0.118±0.008 Estrogen 8 0.132±0.0111)QGKS low-dose 8 0.127±0.0031)QGKS high-dose 8 0.128±0.0021)

2.4OPG和RANKL蛋白表達檢測結(jié)果 模型空白組骨髓內(nèi)基質(zhì)細胞OPG表達水平降低，中藥低劑量組、中藥高劑量組、雌激素預防組較模型空白組明顯(見圖2)。模型空白組骨髓內(nèi)基質(zhì)細胞胞漿RANKL呈高表達，中藥低劑量組、中藥高劑量組、雌激素預防組表達強度減弱，見圖3。模型空白組大鼠股骨的RANKL蛋白平均光密度值較正常對照組、雌激素預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組皆明顯增高，且中藥低劑量組與中藥高劑量組差異無統(tǒng)計學意義;模型空白組大鼠股骨OPG蛋白平均光密度值較正常對照組、雌激素預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組皆顯著降低，且中藥低劑量組與雌激素預防組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，中藥低劑量組與中藥高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表4。

圖1 各組大鼠股骨骨小梁(HE染色，×4)Fig．1 The femoral bone trabecula of each groups(HE staining，×4)

表2 各組大鼠股骨骨小梁面積及骨小梁面積百分數(shù)比較(±s)Tab．2 The comparison between femoral trabecular bonearea and area percentage in each groups(±s)

表2 各組大鼠股骨骨小梁面積及骨小梁面積百分數(shù)比較(±s)Tab．2 The comparison between femoral trabecular bonearea and area percentage in each groups(±s)

Note：Compared with model blank group，1)P＜0.01.

Groups Area(μm2)Area percentage Normal control 651 616.8±12 842.51) 0.480±0.0101)Model blank 253 969.1±18 887.3 0.187±0.014 Estrogen 552 366.8±21 011.61) 0.408±0.0151)QGKS low-dose 503 429.1±11 969.71) 0.372±0.0091)QGKS high-dose 504 990.3±14 185.11) 0.373±0.0101)

表3 各組大鼠股骨骨小梁厚度及骨小梁間距比較(±s)Tab．3 The comparison between femoral trabecular bone thickness and spacing in each groups(±s)

表3 各組大鼠股骨骨小梁厚度及骨小梁間距比較(±s)Tab．3 The comparison between femoral trabecular bone thickness and spacing in each groups(±s)

Note：Compared with model blank group，1)P＜0.01.

Groups Thickness(μm) Spacing(μm)Normal control 119.268±37.0141) 259.810±92.3241)Model blank 53.648±14.679 567.185±210.315 Estrogen 107.419±19.7591) 303.531±171.0551)QGKS low-dose 97.760±18.2591) 317.903±109.7791)QGKS high-dose 99.138±19.0061) 316.427±110.5071)

圖2 各組大鼠股骨OPG蛋白表達(免疫組化染色，×40)Fig．2 The protein expression of OPG in each group(Immunohistochemistry，×40)

圖3 各組大鼠股骨RANKL蛋白表達(免疫組化染色，×40)Fig．3 The protein expression of PANKL in each groups，(Immnuohistochemistry，×40)

表4 各組大鼠股骨OPG及RANKL蛋白表達平均光密度值測定(±s)Tab．4 The measurement of the protein average optical density(AOD)of OPG and RANKL in each groups(±s)

表4 各組大鼠股骨OPG及RANKL蛋白表達平均光密度值測定(±s)Tab．4 The measurement of the protein average optical density(AOD)of OPG and RANKL in each groups(±s)

Note：Compared with model blank group，1)P＜0.01.

Groups n AOD of OPG AOD of RANKL Normal control 9 0.459±0.0161) 0.359±0.0371)Model blank 8 0.318±0.039 0.584±0.043 Estrogen 8 0.381±0.0371) 0.447±0.0231)QGKS low-dose 8 0.361±0.0271) 0.499±0.0271)QGKS high-dose 8 0.374±0.0211) 0.472±0.0331)

3 討論

去卵巢雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型是公認的標準化的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥經(jīng)典病理模型。該模型是目前世界上通用的骨質(zhì)疏松動物模型之一，以松質(zhì)骨丟失為主要特征，較好的模擬成年婦女雌激素缺乏的臨床特點和對雌激素替代療法的反應［3］。去卵巢動物也是中醫(yī)認可的研究腎主骨良好模型［4］。有研究認為4.5～10月齡大鼠的骨量處于相對穩(wěn)定期，選擇該月齡大鼠做模型，研究藥物對骨質(zhì)疏松癥的防治作用是可行的［5］。本實驗選用6月齡雌性大鼠，其骨代謝處于相對穩(wěn)定階段，對其進行卵巢切除術(shù)1月后發(fā)現(xiàn)股骨骨密度下降，骨組織形態(tài)學遭到破壞，說明造模成功，為觀察強骨康疏膠囊早期干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物功效提供了良好的研究基礎。

骨密度是反映骨強度的重要指標之一，也間接評價骨丟失程度。雙能X線骨密度儀是骨質(zhì)疏松癥檢查診斷的首要方法和金標準［6］。而且骨密度在評價大鼠骨質(zhì)疏松模型及療效判定方面也有很好的準確性和精確性［7］。陳東等［8］通過實驗認為，去卵巢大鼠全股骨及股骨遠端與脛骨相比可檢測到明顯的骨量丟失，顯示測定全股骨及股骨遠端骨密度較為敏感，并認為股骨骨組織計量學參數(shù)與骨密度之間存在明顯正相關(guān)性。本實驗說明強骨康疏膠囊能有效提高骨量，預防骨質(zhì)疏松癥。

骨組織形態(tài)計量學是20世紀70年代發(fā)展的一項病理學技術(shù)，在二維的骨組織切片圖像上，利用體視學方法，推導出反映骨結(jié)構(gòu)、骨重建的三維參數(shù)。骨形態(tài)計量學是揭示骨的生理病理改變與組織定量研究的方法，它在研究疾病的發(fā)生機理、評價藥物療效中具有廣泛的應用價值，是評價骨結(jié)構(gòu)與骨轉(zhuǎn)換的有效手段，能直觀、形象地對松質(zhì)骨進行定量分析。將骨礦含量測定與骨組織形態(tài)學結(jié)合在一起，可全面反映骨生理病理與功能變化，從而對骨質(zhì)量做出科學的判斷，為合理評價骨質(zhì)疏松或新藥的藥效提供理論依據(jù)［9］。通過松質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)，可以了解骨質(zhì)疏松模型建立是否成功，干預因素是否有效。骨小梁厚度、骨小梁間距、骨小梁面積百分數(shù)等靜力學指標反映單位面積內(nèi)骨小梁連接狀況和骨小梁本身的結(jié)構(gòu)特征，骨結(jié)構(gòu)越優(yōu)化，骨的抗骨折能力就越強。骨小梁面積百分數(shù)是反映骨量的參數(shù);骨小梁厚度、骨小梁間距是反映骨結(jié)構(gòu)的參數(shù)［10］。本實驗骨組織計量學指標采用國際通用、標準的骨組織形態(tài)計量學學術(shù)語命名［11］。研究表明，去卵巢大鼠單位面積內(nèi)骨的靜力學參數(shù)低于正常對照組，提示骨小梁稀疏、細小和三維結(jié)構(gòu)破壞，這與顯微鏡下觀察到的骨小梁內(nèi)出現(xiàn)大的空洞，且間距增寬的結(jié)果一致。給予補腎壯骨方藥后，骨小梁厚度、骨小梁面積、骨小梁面積百分數(shù)明顯增加，與模型空白組相比有顯著差異;骨小梁間距及骨小梁游離末端明顯減少。這與顯微結(jié)構(gòu)中所見骨小梁密集，三維結(jié)構(gòu)存在相吻合，證明強骨康疏膠囊在維持骨量的同時也延緩了骨結(jié)構(gòu)的破壞。

骨保護蛋白(Osteoprotegerin，OPG)是由Simonet等［12］發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體超家族成員之一。核因子-κβ受體活化因子配體(Receptor-avtivator of nuclear factor kappa beta ligand，RANKL)是腫瘤壞死因子配體超家族成員，成骨細胞通過在細胞表面表達RANKL與破骨細胞前體細胞進行細胞-細胞依賴式接觸，促進破骨細胞的生成［13］。核因子-κβ受體活化因子(Receptor-avtivator of nuclear factor kappa beta，RANK)是腫瘤壞死因子受體家族成員，主要功能是與RANKL結(jié)合，激活RANK，啟動一系列信號轉(zhuǎn)導途徑［14］。OPG/RANK/RANKL分子及其信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)節(jié)骨重建的最重要的分子系統(tǒng)之一，通過其分子生物學方面的研究，對探討骨重建的機制和骨質(zhì)疏松癥的防治具有重要意義。骨組織中RANKL/OPG的變化規(guī)律是指導靶向RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)基因治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重要理論依據(jù)，并且靶向該系統(tǒng)信號通路的基因干預治療對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預防應越早越好［15］。本實驗通過免疫組化染色法檢測去卵巢大鼠股骨OPG及RANKL蛋白的表達，證明強骨康疏膠囊通過提高骨OPG蛋白表達及抑制RANKL蛋白表達，來干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。

從實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中藥低劑量組與中藥高劑量組療效差異無統(tǒng)計學意義，說明在造模初期即絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的早期階段，使用低劑量的強骨康疏膠囊即可以達到早期干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用。綜上，強骨康疏膠囊能夠改善去卵巢大鼠的骨量、骨代謝、骨組織形態(tài)學及骨顯微結(jié)構(gòu)。

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