朵建英，王蔭槐，魏 強(qiáng)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

悉生蠶的研究與應(yīng)用

朵建英，王蔭槐，魏 強(qiáng)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

悉生蠶是指蠶體內(nèi)外棲息的其他生物體是已知的蠶，不僅培育方法較哺乳動(dòng)物簡單，且徹底克服蠶的季節(jié)性和地域性飼育限制，為蠶在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中的廣泛應(yīng)用打下基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，悉生蠶作為生物反應(yīng)發(fā)生器或轉(zhuǎn)基因工程動(dòng)物的應(yīng)用已逐步進(jìn)入實(shí)用化研究階段。

悉生蠶;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物;生物反應(yīng)器;應(yīng)用

蠶是重要而獨(dú)特的經(jīng)濟(jì)昆蟲，至今已被人類馴化利用長達(dá)5000余年。家蠶人工飼料飼育［1，2］方法的研究成功，使家蠶的應(yīng)用擺脫小作坊的生產(chǎn)形式實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。悉生蠶的出現(xiàn)更是打開了家蠶作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行科學(xué)研究、生物材料研制的廣闊前景，逐步在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮不可替代的重要作用。

1 悉生蠶飼育方法的研究

上世紀(jì)60年代初，日本科學(xué)家率先研發(fā)出蠶人工飼料后于1962年飼育成功無菌蠶(germ-free silkworm，簡稱GF蠶)，后由松原藤好總結(jié)創(chuàng)建了獨(dú)特的松原KIT方式全齡化人工飼料工廠化無菌飼育技術(shù)體系［1，3］。隨后我國引進(jìn)該技術(shù)，通過消化吸收與創(chuàng)新，在人工飼料無菌養(yǎng)蠶的研究方面取得長足進(jìn)展［1－4］。但以上養(yǎng)蠶方法中的“無菌”主要是指用于孵化蠶蟻的蠶卵及人工飼料的無菌化處理，其飼育過程雖有在無菌室或無菌箱中進(jìn)行的，但是為了適應(yīng)工業(yè)化大批量生產(chǎn)的需求，環(huán)境空氣潔凈度并沒有達(dá)到隔離環(huán)境要求的級(jí)別，嚴(yán)格來說只能算是已知菌蠶(gnotobiotic silkworm，簡稱 GN蠶)或無特定病原體蠶(specific pathogen free silkworm，簡稱 SPF蠶)。

王蔭槐等［5］在1999年利用隔離系統(tǒng)首次飼育成功GF蠶，結(jié)果顯示GF蠶的成活率和結(jié)繭率均較普通蠶高，蛹成活率在90%以上，為GF蠶作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究及應(yīng)用提供了參考。

2 GN蠶作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)用

GN蠶的生物背景清楚、飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作容易、成本低廉、單批實(shí)驗(yàn)成活率高，可一次性提供遺傳背景一致的500個(gè)左右的實(shí)驗(yàn)個(gè)體，十分適合作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行應(yīng)用和研究。

2.1 進(jìn)行蠶病研究

早在100年前巴斯德就通過解剖蠶體發(fā)現(xiàn)了蠶病與其體內(nèi)微生物有關(guān)系，并在后來的GF蠶上得到驗(yàn)證。Cappellozza S等利用人工飼料飼育無菌蠶幼蟲鑒定出Enterococcus mundtii(蒙氏腸球菌)是蠶軟化病的病原體，繼之對(duì)該細(xì)菌的致病機(jī)制、感染途徑、預(yù)防措施等方面進(jìn)行了研究［6］，研究表明Enterococcus mundtii屬于蠶消化道細(xì)菌，從消化道感染身體其他組織;通過對(duì)卵表面進(jìn)行消毒可以消除母體垂直傳播;飼料中的桑葉粉可能是其傳染源，這些研究結(jié)果在人類該病原菌的流行病學(xué)方面可能起到一定的提示作用。利用GN蠶人們對(duì)Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV，蠶多角體病毒)對(duì)蠶的感染機(jī)制和特征有了更進(jìn)一步的了解，發(fā)現(xiàn)一種神經(jīng)誘導(dǎo)的分化相關(guān)蛋白BmGDAP1，在病毒感染早期的識(shí)別和免疫應(yīng)答階段發(fā)揮很大作用［7］。

2.2 建立感染模型對(duì)致病菌的致病性進(jìn)行研究

日本研究人員用GN蠶幼蟲建立致病菌感染模型研究致病菌對(duì)人類的感染機(jī)制，觀察到金黃色葡萄球菌在幼蟲中腸表面的大量增殖，及其在幼蟲體液和組織中的存在，并發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的植入能降低金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和霍亂弧菌對(duì)幼蟲的致死率［8］。感染不同基因突變型致病菌后的家蠶模型和小鼠模型同樣對(duì)致病菌的致病基因或毒力決定因子具有篩選作用，致病基因或因子缺失突變的菌株對(duì)家蠶的毒性降低［9，10］，通過將突變菌株細(xì)胞培養(yǎng)的上清液注射到幼蟲血淋巴中，可以對(duì)致病菌內(nèi)外毒素的致死劑量進(jìn)行定量研究［11］。近年建立的GN蠶模型更是將金黃色葡萄球菌致病因子的研究準(zhǔn)確到了細(xì)胞壁表面蛋白和各種調(diào)節(jié)蛋白水平［12］。

2.3 利用感染模型對(duì)抗菌藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)

家蠶具有體型小、易操作、實(shí)驗(yàn)周期短的特點(diǎn)，用家蠶替代哺乳動(dòng)物用于新藥研發(fā)早期階段藥物毒性、有效性及體內(nèi)吸收分布的研究是可行并有價(jià)值的。

在研究惡唑烷酮類藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果時(shí)，不同組藥物的半數(shù)有效劑量(ED50)在家蠶幼蟲和嚙齒類動(dòng)物模型中具有相似的趨勢［13］。給予家蠶和小鼠相同的細(xì)胞毒化合物后，發(fā)現(xiàn)化合物在家蠶和小鼠體內(nèi)致死劑量相似，代謝途徑相同，都是與細(xì)胞色素P450反應(yīng)后與羥化物結(jié)合，最后排泄［14］，還可以在家蠶飼料中摻入熒光標(biāo)記化合物，通過觀察熒光進(jìn)一步追蹤外源化合物在家蠶體內(nèi)的吸收和分布［15］，最終證實(shí)了家蠶作為候選藥物特別是新型抗菌藥物早期研發(fā)階段評(píng)價(jià)模型的可行性。利用新型隱球菌感染蠶模型，成功評(píng)價(jià)了抗真菌藥物兩性霉素B、氟胞吡啶、氟康唑和酮康唑?qū)π滦碗[球菌的治療效果［16］。

2.4 GN蠶進(jìn)行生理、毒理學(xué)及放射學(xué)的研究

蠶作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在遺傳育種、昆蟲變態(tài)、昆蟲激素傳遞、性別控制等方面已有很多研究。GF蠶的出現(xiàn)擴(kuò)大和提高了其作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)用范圍和研究水平。Fujii T等［17］的研究證明性別轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子參與家蠶性信息素偏好的轉(zhuǎn)變，這種因子在昆蟲兩性性外激素偏好的選擇及交配行為發(fā)生中起重要作用。增進(jìn)博之等［18］人以 GF蠶作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，測定了單一或混合金屬引起的蠶的毒性反應(yīng)、重金屬的體內(nèi)分布、消長及其向蠶后代轉(zhuǎn)移殘留金屬的分布關(guān)系。Kyeong Ryong Lee等［19］人將家蠶血淋巴加入輻射處理后的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，本應(yīng)出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白(除irp94)和膜蛋白出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，說明蠶血淋巴中含有一種可以調(diào)節(jié)ER蛋白在輻射處理后下調(diào)表達(dá)的因子。

3 GN作為生物反應(yīng)發(fā)生器及其在轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用

家蠶生物反應(yīng)發(fā)生器的研究和開發(fā)主要以家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear polyhedrosis virus，BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)為主，以BmNPV為載體，以外源基因替換或部分替代多角體蛋白基因，從而使重組BmNPV在蠶體細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)外源蛋白［20］，其表達(dá)量高，產(chǎn)物天然性質(zhì)好［21］。近年來研究較多的蠶絲絹細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有其獨(dú)有的優(yōu)越性，將外源基因置于絲心蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下，利用絲腺細(xì)胞表達(dá)外源基因，外源基因能完整的表達(dá)并分泌到絲腺中，表達(dá)量高于 BmNPV表達(dá)系統(tǒng)十幾倍，且目的蛋白純度高、無需進(jìn)行繁瑣的下游濃縮和提純處理［22］。

3.1 生產(chǎn)基因工程疫苗

家蠶生物反應(yīng)器能高水平表達(dá)抗原蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物活性高。Higashihashi等［23］將帶乙肝表面抗原的M蛋白基因克隆到轉(zhuǎn)移載體上，再與野生型病毒共轉(zhuǎn)染獲得重組病毒，以重組病毒感染家蠶幼蟲，可獲得高水平表達(dá)的 HBsAg，達(dá)(400～500)μg/蠶。周耐明等［24］利用重組的BmNPV在家蠶幼蟲及蛹中高效表達(dá)了具有生理活性的 HBsAg，幼蟲表達(dá)量為 750 μg/蠶，蛹為 690 μg/蛹，主要表達(dá)產(chǎn)物以糖基化形式存在，浮力密度為1.2 g/mL，與病人血清中的HBsAg水平一致。于漣［25］等在家蠶中表達(dá)了傳染性法氏囊病病毒的主要宿主保護(hù)性抗原蛋向Vp2，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該蛋白Vp2有良好的免疫原性。構(gòu)建同時(shí)攜帶3個(gè)甲型H1N1流感病毒基因的重組蠶桿狀病毒，在蠶體內(nèi)裝配出甲型H1N1流感病毒樣顆粒［26］;構(gòu)建含有犬細(xì)小病毒衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP2的重組蠶桿狀病毒，在蠶和蠶蛹中表達(dá)出保留了VP2特異免疫活性或狂犬病毒特異免疫活性的病毒樣顆粒［27］，多種病毒的保護(hù)性抗原基因在家蠶BmNPV表達(dá)系統(tǒng)中的成功表達(dá)，為基因工程病毒亞單位疫苗的研發(fā)提供了新的途徑。

3.2 表達(dá)各種醫(yī)用蛋白

通過基因融合的方法，將大腸桿菌的asp基因在家蠶桿狀病毒中表達(dá)，其活性高達(dá)5940 U/mg，為利用家蠶生物反應(yīng)器高效生產(chǎn)該蛋白打下基礎(chǔ)［28］。利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)能夠獲得含有人瘦素蛋白基因及人生長素基因的重組桿狀病毒，并且目的蛋白能在家蠶細(xì)胞及幼蟲體內(nèi)表達(dá)［29，30］。通過構(gòu)建基于piggyBac的中部絲腺特異表達(dá)載體，利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)人干擾素－ω(huIFN－ω)，該重組蛋白huIFN－ω具有一定的抗細(xì)胞增殖活性［31］。家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)人胰島樣生長因子(hIGF-I)，在G0代轉(zhuǎn)基因家蠶的蠶繭中hIGF-I的表達(dá)量約756 ng/g［32］。2004年我國利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)人粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)等生物制品的方法，獲得國家技術(shù)發(fā)明獎(jiǎng)。該項(xiàng)目成功構(gòu)建線性化［33］家蠶桿狀病毒載體，以家蠶蛹作為“生物反應(yīng)器”高效表達(dá)人粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)等60余種醫(yī)用蛋白質(zhì)，建立了家蠶“生物反應(yīng)器”生物制藥的技術(shù)平臺(tái)［34］。使用 GN蠶徹底解決了生物制品生產(chǎn)受季節(jié)限制、蠶蛹冷凍保存影響產(chǎn)量、產(chǎn)品易受微生物(包括蠶病病原體)污染［35］等諸多問題，為提高生物制藥的質(zhì)量和產(chǎn)量提供了新的途徑。

3.3 改善絲素性能

蠶絲在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有較廣泛的用途［36］。使用基因工程技術(shù)，用其他絲素蛋白基因置換或部分置換家蠶絲素蛋白基因或?qū)⑼庠椿蛑糜诮z素蛋白基因下游構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因蠶可以突破傳統(tǒng)育種的限制，獲得具有優(yōu)良絲質(zhì)的家蠶新品種［37－39］。此外，通過基因打靶的技術(shù)將外源基因?qū)爰倚Q得到完全表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因蠶的思路受到人們的重視。這種技術(shù)一旦成熟，人們獲得會(huì)吐蜘蛛絲［40］、蓖麻蠶絲、樟蠶絲、天蠶絲的轉(zhuǎn)基因家蠶［41］，這些以前產(chǎn)量稀少的材料就不再難以獲得了。利用GN蠶代替普通蠶進(jìn)行“蠶絲”的生產(chǎn)，不但可以實(shí)現(xiàn)全年化生產(chǎn)，還可以通過改變GN蠶飼料大大改善“蠶絲”性能，此外，無菌技術(shù)的使用還利于轉(zhuǎn)基因蠶的保種和繁殖擴(kuò)增。

4 GN蠶蠶體各組織器官的作用

家蠶渾身是寶，雖已被人類馴化利用長達(dá)5 000余年，但尚遠(yuǎn)未研究開發(fā)殆盡。

4.1 作為輕工業(yè)或生物科技原材料

利用GF蠶生產(chǎn)的無菌蠶絲色澤白亮、纖度細(xì)而韌度強(qiáng)，并能實(shí)現(xiàn)全年工廠化生產(chǎn)，大大推動(dòng)了蠶絲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［42，43］。印度柞蠶絲作為心臟組織工程中支架材料的使用已經(jīng)得到認(rèn)可［44］，蠶絲中提取的絲膠蛋白已經(jīng)被作為一種傷口敷料［45］和一種美容劑的添加劑［46］得到使用。

4.2 作為藥物或藥物添加劑

蠶血淋巴作為藥物添加劑的抗衰老作用得到證實(shí)［47］，蠶繭提取物具有抗氧化和降血脂的作用，對(duì)高血脂和動(dòng)脈粥樣硬化療效顯著［48］。蠶粉能減少糖尿病小鼠小丘腦加壓素的產(chǎn)生［49］，可能作為治療糖尿病，特別是糖尿病神經(jīng)病變的輔助添加劑。含超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的蠶粉能引起肝癌小鼠自然殺傷細(xì)胞(NK cell)活性增強(qiáng)、脾細(xì)胞增殖，對(duì)肝癌細(xì)胞起到顯著抑制作用，可以作為一種安全的能激活NK細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的腫瘤抑制劑［50］。

4.3 作為中藥材的使用

蠶衣、僵蠶、僵蛹、蠶沙和蛹蟲草等作為傳統(tǒng)中藥材使用時(shí)，既沒有藥材標(biāo)準(zhǔn)，更沒有良好的生產(chǎn)環(huán)境，產(chǎn)品質(zhì)量沒有保證。如果用GF蠶來生產(chǎn)蠶衣、僵蠶、僵蛹、蠶沙和蛹蟲草，可有效控制雜菌的污染，提高中藥材生產(chǎn)質(zhì)量，保證用藥安全有效。

冬蟲夏草是我國十分名貴的中藥材，人工栽培的蛹蟲草或北蟲草與其在營養(yǎng)元素、有效物質(zhì)成分等方面很相似［51，52］，雖然可在一定程度上代替稀有的冬蟲夏草作為藥品或保健品進(jìn)行使用，但其不具備藥材學(xué)上完整的“蟲草”外形特征，由于“蟲”的缺失，一方面可能導(dǎo)致“草”生長過程中與宿主相互作用產(chǎn)生的某些物質(zhì)，如抗體等的缺失，另一方面也是導(dǎo)致蟲草無性培育時(shí)菌株質(zhì)量連年下降的重要原因之一。

利用GF蠶幼蟲代替蝙蝠蛾幼蟲接種蟲草菌進(jìn)行冬蟲夏草的人工培育可以為人們提供一個(gè)深入研究冬蟲夏草形成、培育與有效物質(zhì)藥理活性的良好素材。冬蟲夏草是一種真菌與昆蟲的結(jié)合體，蟲體感染過程中是否有其他真菌的參與，各種菌所起的作用是什么，在什么時(shí)期起作用等問題還尚不明了，GF蠶幼蟲感染蟲草菌模型能很好的解決這一問題。同時(shí)，GF蠶蟲草的培育成功還可以為高純度蟲草菌的分離純化，及高質(zhì)量、無污染蟲草產(chǎn)品的獲得提供可靠的途徑。

5 小結(jié)與展望

GN蠶排除了其他微生物對(duì)宿主的影響，為蠶病致病菌致病機(jī)制的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)使用GN蠶作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可一次獲得500個(gè)左右遺傳背景一致的實(shí)驗(yàn)個(gè)體，且體型小、便于操作、成本低廉、容易分離器官和血淋巴，熒光化合物的使用證實(shí)了化合物在蠶體和小鼠體內(nèi)代謝途徑的一致性，這些特點(diǎn)使GN蠶替代哺乳動(dòng)物作為新藥研發(fā)早期階段，特別是合成化合物量很少的情況下，評(píng)價(jià)化合物毒性、治療效果的有效模型提供了可行性。

蠶生物反應(yīng)器有基因工程產(chǎn)品“微型發(fā)酵罐”之稱，GN蠶BmNPV表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建不但能有效提高外源蛋白產(chǎn)量，還能從根本上改善外源蛋白的質(zhì)量，徹底解決產(chǎn)物，特別是基因工程口服藥物的微生物污染問題。蠶絲絹體細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)目的蛋白產(chǎn)量高、產(chǎn)物無需進(jìn)行繁瑣的下游濃縮和提純處理［53］，具有很大的開發(fā)前景，如果將轉(zhuǎn)基因后的蠶卵進(jìn)行人工無菌飼育，其絲絹體表達(dá)系統(tǒng)的遺傳性狀不變，但絲素性質(zhì)應(yīng)該會(huì)得到很大改善。

GF蠶體內(nèi)外無微生物，整個(gè)生長過程無污染的特點(diǎn)使其作為中、西藥材料，保健品、藥品添加劑甚至是食品時(shí)具有普通家蠶無可比擬的優(yōu)越性。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)對(duì)蠶體的應(yīng)用沒有藥材標(biāo)準(zhǔn)，GF蠶作為中藥原料可提高藥材質(zhì)量，保證用藥安全。隨著人們對(duì)家蠶研究的深入，絲蛋白、絲膠蛋白越來越多的潛在價(jià)值被發(fā)掘出來，最近的研究表明，絲膠蛋白能加速乙醇通過尿的排除和在肝中的氧化作用，絲膠蛋白的水解產(chǎn)物還能誘導(dǎo)胰島中β細(xì)胞的活性而增加胰島素的分泌［54］，預(yù)示絲蛋白是一種生物調(diào)節(jié)因子，可能在解酒劑、糖尿病藥物的研發(fā)方面發(fā)揮新的作用。通過對(duì)絲蛋白在提高免疫力方面作用的研究，證實(shí)其能作為一種食品中的免疫增強(qiáng)添加劑得到開發(fā)。運(yùn)用GF蠶可以生產(chǎn)出無抗生素、微生物污染的絲蛋白、絲膠蛋白產(chǎn)品，更能簡化提取工藝，提高生產(chǎn)效率、節(jié)約成本。

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Research and Application of Gnotobiotic Silkworm

DUO Jian-ying，WANG Yin-huai，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine;Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

The silkworm with no unknown organisms living in or outside its body called gnotobiotic silikworm.The foster methods of gnotobiotic silikworm is much easier then that of mammal ones，and completely overcomed seasonal and regional breeding limits.Gnotobiotic silikworm lay the foundation for its wide application in laboratory animal science.With the development of modern biotechnology，study on the application of gnotobiotic silikworm as a bioreactor generator or genetic engineering animal has been gradually developed into the practical stage.

Gnotobiotic silkworm;Laboratory animal;Bioreactor generator;Application

R33

A

1671-7856(2012)08-0068-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.016

2012-06-05

科技重大專項(xiàng)－艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治，項(xiàng)目號(hào)2012ZX10004－501。

朵建英(1984－)，女，碩士，技師，從事悉生動(dòng)物研究工作。

魏強(qiáng)，男，教授，博士導(dǎo)師，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。E-mail:weiqiang0430@sohu.com。