銀曉端， 曾 麗， 周建波

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)并且以炎性脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病，本病病因至今尚未完全清楚，炎癥通常被認(rèn)為在自身免疫性疾病的發(fā)病過程中起了至關(guān)重要的作用。因此，對(duì)炎癥的相關(guān)研究是探索MS發(fā)病機(jī)制中的重要方面。近年來發(fā)現(xiàn)，許多感染性疾病和自身免疫疾病的發(fā)生與NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切［1］，但目前為止，國內(nèi)尚未見NLRP3炎性小體與MS或EAE關(guān)系的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬從NLRP3炎性小體入手，通過對(duì)MS的經(jīng)典動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性脊髓炎大鼠(EAE)的研究，探索其是否參與MS炎性反應(yīng)的發(fā)生，以及其上下游參與炎性反應(yīng)發(fā)生的靶分子caspase-1、IL-1β細(xì)胞因子的表達(dá)情況。闡明NLRP3炎性小體信號(hào)通路在MS炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制，將可能為MS的診斷和治療提供新的思路。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 選取10只健康豚鼠，體重300～400g，雌雄不限，用于制備抗原。健康純種遠(yuǎn)交雌性Wistar大鼠30只，體重180～220g，8～10周齡。將大鼠隨機(jī)分為兩組，分別為正常對(duì)照組10只、EAE模型組20只。以上動(dòng)物均由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1．2 EAE模型制備 用10%水合氯醛按0．5 ml/100g將豚鼠麻醉后斷頭處死，在冰上迅速解剖分離出脊髓，并去除脊髓表面的脊膜，再稱重，加入等量4℃的0．9%生理鹽水，勻漿后制成50%的脊髓勻漿液(GPSCH)，再加入等量的含6mg/ml卡介苗的完全弗式佐劑(CFA，Sigma公司)，混勻后用玻璃注射器抽打制成油包水型乳劑抗原GPSCH-CFA。

1．3 動(dòng)物免疫和干預(yù) 將大鼠用10%水合氯醛按0．5ml/100g麻醉，模型組每只大鼠分別給予0．5ml的GPSCH-CFA，于雙后足墊真皮下和頸部皮下3點(diǎn)進(jìn)行皮下注射;對(duì)照組在相同部位注射0．5ml的CFA混合劑(完全弗氏佐劑和生理鹽水按1∶1等體積混合，不含GPSCH)。免疫當(dāng)天計(jì)為0d。

1．4 EAE模型成功標(biāo)準(zhǔn) 從0d起每日上午觀察大鼠行為學(xué)方面的變化，同時(shí)測量體重并詳細(xì)記錄。神經(jīng)功能評(píng)分采用7分評(píng)分法［2］:0分:不發(fā)病;1分:動(dòng)物皮毛不光整，尾部無力;2分:尾巴癱瘓無力;3分:尾巴癱瘓無力加后肢無力;4分:尾部癱瘓無力加部分后肢癱瘓;5分:后肢完全癱瘓;6分:后肢+前肢癱瘓;7分:瀕死或死亡狀態(tài)。

1．5 組織病理學(xué)觀察 對(duì)照組在免疫后第21天統(tǒng)一處死，模型組評(píng)分1分以上的發(fā)病大鼠在發(fā)病后病情高峰時(shí)(大鼠神經(jīng)癥狀持續(xù)不增而體重增加，或神經(jīng)癥狀開始緩解)處死大鼠，用10%水合氯醛按0．5ml/100g進(jìn)行腹腔注射麻醉，先后用生理鹽水及4%多聚甲醛常規(guī)灌注，解剖分離出大腦、腦干、脊髓放在4%多聚甲醛中固定24h，然后逐級(jí)酒精脫水、包埋、切片，常規(guī)HE染色，砂羅硌花青法髓鞘染色，光學(xué)顯微鏡觀察病理改變和脫髓鞘情況。

1．6 免疫組化 SP法檢測 NLRP3、caspase-1、IL-1β的表達(dá)。兔抗大鼠NLRP3、caspase-1、IL-1β多克隆抗體為北京博奧森試劑，SP免疫組化檢測系統(tǒng)及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋有限公司。將各部位標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后作5μm連續(xù)切片，余下步驟按免疫組化試劑盒說明進(jìn)行，以細(xì)胞膜或胞漿黃色或棕黃色為陽性。陰性對(duì)照采用0．01mmol/L的PBS代替一抗，其余方法相同。所有大鼠大腦、腦干、脊髓各取3張切片，每張切片取互不重疊的5個(gè)400×倍視野。采用Image-Pro Plus 6．0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)各視野的陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/視野)并計(jì)算其平均光密度(積分光密度/面積，IOD/area)。

2 結(jié)果

2．1 一般情況觀察 所有大鼠免疫后的前3d均有體重下降。對(duì)照組大鼠3d后體重開始回升并持續(xù)增加，無1例發(fā)病。模型組免疫后第13天開始發(fā)病，伴體重持續(xù)下降，各大鼠發(fā)病后反應(yīng)遲鈍、毛色晦暗、尾部無力，部分出現(xiàn)肢體癱瘓。模型組發(fā)病13只，發(fā)病率為65%，無1只死亡。EAE模型組高峰時(shí)發(fā)病癥狀的評(píng)分為4．56±1．43。

2．2 組織病理學(xué)改變 HE染色可見:模型組發(fā)病大鼠大腦、腦干、脊髓內(nèi)有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤，部分小血管呈袖套樣改變。對(duì)照組未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(見圖1)。髓鞘染色可見:模型組發(fā)病的大鼠腦組織和脊髓結(jié)構(gòu)疏松，呈彌漫性脫髓鞘改變，而對(duì)照組大鼠未見異常改變(見圖1)。

2．3 NLRP3的表達(dá) 各部位陽性細(xì)胞數(shù)比較，大腦、中腦、脊髓模型組均高于正常組(P＜0．05)。各部位平均光密度值相比，中腦和脊髓模型組高于對(duì)照組(P＜0．05)(見表1、圖2)。

2．4 caspase-1的表達(dá) 各部位細(xì)胞數(shù)比較，大腦、中腦、脊髓模型組均高于正常組(P＜0．05)。平均光密度值相比，各部位平均光密度值相比，中腦和脊髓模型組高于對(duì)照組(P＜0．05)(見表2、圖2)。

2．5 IL-1β的表達(dá) 各部位細(xì)胞數(shù)比較，大腦、中腦、脊髓模型組均高于正常組(P＜0．05)。各部位平均光密度值相比，大腦、中腦和脊髓模型組高于對(duì)照組(P＜0．05)(見表3、圖2)。

2．6 NLRP3、caspase-1、IL-1β 的相關(guān)性檢測分別對(duì)正常組、模型組的各項(xiàng)指標(biāo)間的平均光密度值進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。正常組的各指標(biāo)之間的表達(dá)量均無相關(guān)性。而模型組的NLRP3與caspase-1的表達(dá)有明顯相關(guān)(r=0．715，P＜0．05)，而與 IL-1β 的表達(dá)無明顯相關(guān)(P＞0．05);同時(shí)模型組的caspase-1與IL-1β 的表達(dá)也明顯相關(guān)(r=0．821，P＜0．05)。

表1 NLRP3的表達(dá)(±s)

表1 NLRP3的表達(dá)(±s)

與正常組比較*P＜0．05

陽性細(xì)胞數(shù)平均光密度值組別大腦 中腦 脊髓正常組模型組大腦 中腦 脊髓6．4 ±1．1 8．3 ±0．9 2．8 ±1．2 6．1 ±0．7*6．9 ±1．3 10．5 ±2．5*0．1149 ±0．0211 0．1153 ±0．0059 0．1200 ±0．0089 0．1451 ±0．0087*0．1185 ±0．0172 0．1429 ±0．0228*

表2 caspase-1的表達(dá)(±s)

表2 caspase-1的表達(dá)(±s)

與正常組比較*P＜0．05

陽性細(xì)胞數(shù)平均光密度值組別大腦 中腦 脊髓正常組模型組大腦 中腦 脊髓10．9 ±2．7 14．8 ±1．2 6．3 ±0．9 11．8 ±2．3*11．9 ±1．9 20．4 ±1．9*0．1339 ±0．0051 0．1466 ±0．0102 0．1449 ±0．1192 0．1927 ±0．0051*0．1487 ±0．0141 0．1689 ±0．0203*

表3 IL-1β 的表達(dá)(±s)

表3 IL-1β 的表達(dá)(±s)

與正常組比較*P＜0．05

陽性細(xì)胞數(shù)平均光密度值組別大腦 中腦 脊髓正常組模型組大腦 中腦 脊髓10．9 ±2．7 14．8 ±1．2 6．3 ±0．9 11．8 ±2．3*11．9 ±1．9 20．4 ±1．9*0．1339 ±0．0051 0．1466 ±0．0102 0．1449 ±0．1192 0．1927 ±0．0051*0．1487 ±0．0141 0．1689 ±0．0203*

3 討論

NLRPs蛋白家族在調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫方面具有重要意義，其通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式能迅速啟動(dòng)先天性免疫，在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮重要作用，其在先天性免疫中參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，還與一些自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［3］。NLRPs蛋白家族中已經(jīng)報(bào)道通過形成炎性小體發(fā)揮功能的分子主要有4個(gè)，包括NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM-2。NLRP3炎性小體是目前研究最多的一種炎性小體，其作為天然固有免疫的重要組分，能被多種類型的病原體或危險(xiǎn)信號(hào)所激活，因此NLRP3炎性小體在多種疾病過程中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用，從最初被確認(rèn)的家族性周期性自身炎癥反應(yīng)到2型糖尿病、阿爾海默茨病和動(dòng)脈粥樣硬化癥等［4］。

國外有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因敲除后EAE的潛伏期延長、臨床癥狀改善、髓鞘脫失減輕、炎性細(xì)胞浸潤減少、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生減少［5］。Guarda等的研究還發(fā)現(xiàn)，I型干擾素用于治療MS的作用機(jī)制之一，就是其能通過減少NLRP3等炎性小體的激活來減少IL-l的生成［6］。由此可見，NLRP3可能參與MS的發(fā)病，但是NLRP3在EAE上的作用未見有相關(guān)研究驗(yàn)證。此外，NLRP3已在很多疾病研究中被證實(shí)會(huì)表達(dá)增高，至于在EAE中是否表達(dá)升高，其意義又如何，國內(nèi)未見有相關(guān)報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該方面進(jìn)行了相關(guān)探索。

在本次實(shí)驗(yàn)中，我們用豚鼠脊髓勻漿作為抗原免疫Wistar大鼠成功誘導(dǎo)了EAE做為MS模型，該MS模型發(fā)病病程呈多樣性，而且炎癥反應(yīng)較重［7］，因此適合用做研究EAE炎性反應(yīng)的研究對(duì)象。本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)發(fā)病大鼠的癥狀觀察、HE染色和髓鞘染色均發(fā)現(xiàn)，該模型的臨床癥狀、炎性細(xì)胞浸潤、髓鞘脫失情況均符合MS的病變特點(diǎn)。同時(shí)免疫組化結(jié)果表明，模型組的 NLRP3、caspase-1、IL-lβ 與對(duì)照組對(duì)比有顯著差異，提示 NLRP3、caspase-1、IL-lβ 與EAE的發(fā)病過程、炎癥浸潤和脫髓鞘關(guān)系密切，這也提示了 NLRP3、caspase-1、IL-lβ 可能參與了 MS發(fā)病。NLRP3在EAE中表達(dá)上調(diào)目前認(rèn)為有兩種可能:(1)NLRP3作為Nod樣受體亞家族成員之一主要表達(dá)在單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等炎性細(xì)胞中［8］。NLRP3在EAE的腦組織和脊髓的表達(dá)隨著大量炎性細(xì)胞的浸潤而增多。(2)炎癥中一些危險(xiǎn)信號(hào)和代謝產(chǎn)物如細(xì)胞壞死產(chǎn)物、異常代謝產(chǎn)物等，以及EAE制模過程中使用的免疫佐劑的卡介苗，都能不同程度地激活NLRP3［9］，從而導(dǎo)致其表達(dá)增多。

本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，caspase-1、IL-lβ在EAE的表達(dá)增多，且 EAE的 NLRP3與 caspase-1、IL-1β與caspase-1的表達(dá)量均有相關(guān)性，與NLRP3炎性小體的作用機(jī)制有關(guān):NLRP3被激活后會(huì)形成蛋白復(fù)合物-NLRP3炎性小體，同時(shí)活化 caspase-1，活化的caspase-1再對(duì)pro-IL-1β、pro-IL-18等細(xì)胞因子底物進(jìn)行剪接，促進(jìn)IL-lβ、IL-18等生成和分泌［10］。但是不僅是NLRP3炎性體，還有諸如NLRP1等其他炎性體能激活caspase-1。因此本實(shí)驗(yàn)中模型組的IL-1β與NLRP3相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是EAE發(fā)病中還有除了NLRP3之外的其它炎性體被激活，導(dǎo)致后來IL-lβ的形成與NLRP3表達(dá)量的相關(guān)性不明顯。被caspase-1處理后生成的IL-lβ、IL-18同屬于IL-l超家族，二者都是重要的促炎性因子，都能通過結(jié)合相應(yīng)的受體激活下游的炎性通路，從而促進(jìn)如IL-3、IL-5、IL-6、IL-13等炎癥因子的釋放。但是它們之間還是有所區(qū)別的:IL-lβ能促進(jìn) T細(xì)胞的增殖，在Th17細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用［11］;IL-18能夠誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)和分泌，刺激Th1或Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［12］。上述觀點(diǎn)與Gris等的研究結(jié)論一致，他們發(fā)現(xiàn)缺乏NLRP3會(huì)導(dǎo)致EAE的IFN-γ和IL-17合成和分泌的減少，提示NLRP3炎性小體能通過增加IL-lβ和IL-18來刺激Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞的增殖和分化，參與EAE的炎癥反應(yīng)［5］。

本研究為NLRP3炎性體和IL-1β在EAE大鼠的發(fā)病中起到重要作用這一假說提供了有力證據(jù)。但MS炎性反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為是細(xì)胞免疫介導(dǎo)的自身免疫疾病，同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示可能還有其他炎性小體參與了EAE的發(fā)病，因此還應(yīng)研究NLRP3與其他炎性小體的之間的相互聯(lián)系，并觀察NLRP3對(duì)各亞型淋巴細(xì)胞變化的影響，探討NLRP3在EAE中的變化規(guī)律和作用機(jī)制，以便為研究MS的研究提供新的切入點(diǎn)，完善MS的發(fā)病機(jī)制。

圖1 A:正常組HE;B:模型組HE;C:正常組髓鞘;D:模型組髓鞘(病理染色×400)

圖2 A:正常組;B:模型組(從左到右依次為NLRP3、caspase-1、IL-1β免疫組化染色×400)

［1］Strowig T，Henao-Mejia J，Elinav E，et al．Inflammasomes in health and disease［J］．Nature，2012，481(7381):278 －286．

［2］Hooper DC，Spitsin S，Kean RB，et al．Uric acid，a natural scavenger of peroxynitrite，in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(2):675 －680．

［3］林福全．固有免疫模式受體NALPs的信號(hào)通路及其與自身免疫性疾病的研究進(jìn)展［J］．國際免疫學(xué)雜志，2008，31(6):419 －422．

［4］毛開睿，孫 兵．NLRP3炎癥小體研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代免疫學(xué)，2011，31(1):1 －4．

［5］Gris D，Ye Z，Iocca HA，et al．NLRP3 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by mediating Th1 and Th17 responses［J］．J Immunol，2010，185(2):974 －981．

［6］Guarda G，Braun M，Staehli F，et al．Type I interferon inhibits interleukin-1 production and inflammasome activation［J］．Immunity，2011，34(2):213 －223．

［7］Dong M，Liu R，Guo L，et al．Pathological findings in rats with experimental allergic encephalomyelitis［J］．APMIS，2008，116(11):972 －984．

［8］Ting JP，Davis BK．CATERPILLER:a novel gene family important in immunity，cell death，and diseases［J］．Annu Rev Immunol，2005，23:387－414．

［9］Lalor SJ，Dungan LS，Sutton CE，et al．Caspase-1-processed cytokines IL-1beta and IL-18 promote IL-17 production by gammadelta and CD4 T cells that mediate autoimmunity［J］．J Immunol，2011，186(10):5738－5748．

［10］Martinon F，Burns K，Tschopp J．The inflammasome:a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta［J］．Mol Cell，2002，10(2):417 －426．

［11］Chung Y，Chang SH，Martinez GJ，et al．Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling［J］．Immunity，2009，30(4):576 －587．

［12］Sims JE，Smith DE．The IL-1 family:regulators of immunity［J］．Nat Rev Immunol，2010，10(2):89 －102．