徐倩，曹凱，周曉慧，王小杰，王一帆，杜超

(承德醫(yī)學院，河北承德067000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis)是當今社會發(fā)病率最高、危害最大的疾病之一［1］，它是多種心腦血管事件的病理基礎(chǔ)，可誘發(fā)多種中老年常見?。?］。動脈粥樣硬化的病理機制十分復雜，其中心環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮的損傷，內(nèi)皮形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和功能受損是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動因素之一［3］。高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化的獨立危險因素之一［4］，可損傷內(nèi)皮細胞從而啟動動脈粥樣硬化。一氧化氮(nitric oxide，NO)是檢測血管內(nèi)皮功能的重要的血清指標之一。

丹皮酚(paeonol)作為傳統(tǒng)的中藥有效成分，具有廣泛的藥理活性，其中在心血管方面有抗動脈粥樣硬化，抗血栓，抗心律失常等作用［5］。本研究以同型半胱氨酸為損傷因子建立內(nèi)皮細胞損傷模型，通過觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)學變化，檢測細胞活力、一氧化氮合酶(eNOS)的表達及細胞培養(yǎng)液中NO水平，觀察丹皮酚對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Veins Endothelial Cells，HUVECs)的保護作用，并探討其分子機制，為臨床應用丹皮酚防治動脈粥樣硬化提供有價值的實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購自CLACK公司。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購于Pepro Tech公司。同型半胱氨酸購于Sigma公司。丹皮酚注射液(5 mg/mL，批號為20110603)購于寧波天真制藥有限公司。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購于大連寶生物工程有限公司，DEPC購于amresco公司，Trizol購于invitrogen公司，DNA Maker購于BIO BASIC INC公司。eNOS引物、β-actin引物由上海生物工程有限公司設(shè)計。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器HERAcell 150型CO2孵育箱(Heraeus公司);LEICA DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡(Wetzlar GmbH公司);Multiskan MK3酶聯(lián)儀(Thermo公司);DU800型紫外可見分光光度計(BECKMAN COULTER公司);ZF型紫外透射反射分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.3 HUVECs培養(yǎng)及分組于承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院取健康剖腹產(chǎn)婦新生胎兒臍帶，在無菌操作臺內(nèi)剪去臍帶夾痕及血腫處，用D-Hanks液將臍帶沖洗干凈，用1∶1的0.1%Ⅰ型膠原酶、0.25%的胰酶－0.02%EDTA(V/V=1∶1)消化13 min，收集消化液，然后用D-Hanks液沖洗管腔2次，將消化液與沖洗液一并收集于離心管中。1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含20%胎牛血清、10 μg/L bFGF的DMEM培養(yǎng)基，用吸管吹打均勻后，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后換液，以后每2 d換1次液。待細胞達到80%～90%融合時，用0.125%胰酶－0.01%EDTA(V/V=1∶1)消化傳代。實驗用第2代細胞，實驗分為5組:正常對照組、同型半胱氨酸損傷模型組(同型半胱氨酸10 mmol/L組)、丹皮酚低劑量組(同型半胱氨酸10 mmol/L+0.15 mmol/L丹皮酚)、丹皮酚中劑量組(同型半胱氨酸10 mmol/L+0.3 mmol/L丹皮酚)、丹皮酚高劑量組(同型半胱氨酸10 mmol/L+0.6 mmol/L丹皮酚)。上述各分組細胞加含20%胎牛血清、10 μg/L bFGF的DMEM培養(yǎng)基。各分組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 細胞形態(tài)觀察倒置顯微鏡(×40)觀察各組HUVECs細胞形態(tài)學變化。

1.5 MTT法檢測細胞活力當原代細胞達到80%～90%融合時，用體積比為1∶1的0.125%胰酶－0.01%EDTA消化，以1.0×108個/L細胞懸液的密度，接種于96孔板，每孔200 μL。待細胞達到80%～90%融合時，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入200 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，使細胞同步化。24 h后，按實驗分組施加干預。每組設(shè)6個復孔，同時設(shè)置空白對照(只有培養(yǎng)液，無細胞)。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔再加入二甲基亞砜150 μL。充分振蕩，待甲臜結(jié)晶全部溶解后，用酶聯(lián)儀測定在波長490 nm處各孔的吸光度值。

1.6 RT-PCR法檢測各組HUVECs中eNOS mRNA的表達將第2代HUVECs細胞以1.5×108個/L的密度接種于6孔培養(yǎng)板中。提取RNA時，每孔加入Trizol 1 mL，按一步法提取各組細胞總RNA。按TaKaRa RNA PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再擴增成DNA。eNOS擴增條件為:94℃預變性2 min，94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增35個循環(huán)。最后10℃延伸20 min。內(nèi)參照β-actin擴增條件為:94℃預變性2 min，94℃變性30s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增35個循環(huán)。最后10℃延伸20 min。eNOS上游序列為:5’CCAGCATCCCTACTCCCACCAG3’，下游序列為:5’CACCTCGGCTTCCACCTCTTG3’。擴增片段為348 bp。β-actin上游序列為:5’AGCGGGAAATCGTGCGTGAC3’，下游序列為:5’ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3’。擴增片段為453 bp。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外透射儀拍攝圖象。用Quantity One軟件進行定量分析，eNOS mRNA相對表達強度=eNOS mRNA掃描值/β-actin mRNA掃描值。實驗重復5次。

1.7 硝酸還原酶法檢測各組HUVECs培養(yǎng)液中NO水平吸取6孔培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)液，按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行測定，通過顯色深淺即吸光度的不同測定NO水平的高低。結(jié)果按下列公式計算:

×標準品濃度(100 μmol/L)×樣品測試前稀釋倍數(shù)。1.8統(tǒng)計學處理運用SPSS 11.5進行統(tǒng)計學分析，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察各組HUVECs細胞形態(tài)學變化與正常對照組比較，同型半胱氨酸損傷模型組細胞呈團簇狀，輪廓不清，有較多細胞脫落。丹皮酚各劑量組的細胞數(shù)量較多，細胞間隙逐漸變窄，形態(tài)趨于正常。

2.2 不同濃度丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs細胞活力的影響同型半胱氨酸損傷模型組細胞活力最低(P＜0.01)，隨著丹皮酚濃度由低到高，丹皮酚各劑量組細胞活力也明顯升高(P＜0.05)。見表1。說明此劑量的同型半胱氨酸可使內(nèi)皮細胞受到損傷，活性下降，而不同濃度的丹皮酚可以明顯抑制同型半胱氨酸的損傷作用。

表1 丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs細胞活力的影響(±s，n=5)Tab.1 Effect of paeonol on the cell viability in HUVECs induced by homocysteine in each group by the method of MTT(±s，n=5)

表1 丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs細胞活力的影響(±s，n=5)Tab.1 Effect of paeonol on the cell viability in HUVECs induced by homocysteine in each group by the method of MTT(±s，n=5)

注:與正常對照組比較，△P＜0.01;與同型半胱氨酸損傷模型組比較，*P＜0.05。

組別丹皮酚/(mmol·L－1)A 值正常對照組同型半胱氨酸損傷模型組丹皮酚低劑量組丹皮酚中劑量組丹皮酚高劑量組－－0.15 0.3 0.6 0.537 7±0.016 7 0.256 0±0.030 6△0.305 2±0.033 1*0.450 0±0.020 3*0.508 8±0.024 5*

2.3 不同濃度丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs eNOS mRNA表達的影響同型半胱氨酸損傷模型組eNOS mRNA的表達明顯降低(P＜0.01)，而丹皮酚各劑量組的eNOS mRNA表達明顯增強(P＜0.01)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(P＜0.05)。表明丹皮酚能阻斷丹皮酚下調(diào)eNOS mRNA的表達，且具有一定的劑量依賴性。見表2，圖1。

表2 丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs eNOS m RNA表達的影響(±s，n=5)Tab.2 Effect of paeonol on the expression of eNOS m RNA in HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

表2 丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs eNOS m RNA表達的影響(±s，n=5)Tab.2 Effect of paeonol on the expression of eNOS m RNA in HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

注:與正常對照組比較，△P＜0.01;與同型半胱氨酸損傷模型組比較，*P＜0.01。

組別丹皮酚/(mmol·L－1)eNOS/β-actin正常對照組－0.521 8±0.020 2同型半胱氨酸損傷模型組－0.166 7±0.015 3△丹皮酚低劑量組0.15 0.253 3±0.025 2*丹皮酚中劑量組0.3 0.355 9±0.013 2*丹皮酚高劑量組0.6 0.413 3±0.015 3*

2.4 不同濃度丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs培養(yǎng)液中NO水平的影響與正常對照組比較，同型半胱氨酸損傷模型組HUVECs培養(yǎng)液中NO水平明顯降低(P＜0.01)。而加入丹皮酚后，隨著丹皮酚濃度的增加，HUVECs培養(yǎng)液中NO水平也逐漸升高，與同型半胱氨酸損傷模型組比較，丹皮酚各劑量組NO水平明顯升高(P＜0.05)。見表3。

3 討論

圖1 丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs eNOS mRNA表達的影響Fig.1 Effect of paeonol on the expression of eNOS mRNA in HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

表3 丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs培養(yǎng)液中NO水平的影響(±s，n=5)Tab.3 Effect of paeonol on the content of NO in the cultured supernate of HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

表3 丹皮酚對同型半胱氨酸損傷HUVECs培養(yǎng)液中NO水平的影響(±s，n=5)Tab.3 Effect of paeonol on the content of NO in the cultured supernate of HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

注:與正常對照組比較，△P＜0.01;與同型半胱氨酸損傷模型組比較，*P＜0.05。

組別丹皮酚/(mmol·L－1)NO/(μmoL·L－1)正常對照組－174.137 9±3.216 5同型半胱氨酸損傷模型組－84.356 3±6.054 9△丹皮酚低劑量組0.15 113.793 1±4.561 6*丹皮酚中劑量組0.3 141.954 0±4.338 9*丹皮酚高劑量組0.6 158.046 5±5.217 7*

大量研究表明高同型半胱氨酸血癥是導致動脈粥樣硬化的的獨立危險因素之一。同型半胱氨酸是非蛋白構(gòu)成型含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代謝過程中一個重要的中間產(chǎn)物［6］。同型半胱氨酸在血管內(nèi)皮細胞內(nèi)過分蓄積時，有直接損傷內(nèi)皮細胞的作用。而內(nèi)皮損傷是導致動脈粥樣硬化的始動因素之一。丹皮酚亦稱牡丹酚，是中藥牡丹皮(芍藥科植物牡丹根皮)和徐長卿(蘿摩科植物徐長卿的全草)的主要活性成分，具有抗動脈硬化，抗心律失常等作用［7］。

本研究采用同型半胱氨酸誘導HUVECs損傷的模型。研究結(jié)果顯示，同型半胱氨酸損傷模型組，細胞活力明顯下降，在倒置相差顯微鏡下觀察，可見細胞呈團簇狀，輪廓不清，出現(xiàn)片狀分離，脫落現(xiàn)象。丹皮酚干預后，隨著丹皮酚濃度的升高，同型半胱氨酸損傷的細胞活力顯著提高，細胞間隙逐漸變窄，形態(tài)趨于正常。表明丹皮酚對同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細胞有直接的保護作用。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是檢測內(nèi)皮功能的重要的指標，最初被稱為內(nèi)皮衍生舒張因子，可舒張血管，抑制縮血管物質(zhì)的分泌，抑制血管平滑肌細胞遷移、增殖和血小板聚集，抑制單核-巨噬細胞與內(nèi)皮細胞黏附等［8］，因此被稱為“內(nèi)源性抗動脈粥樣硬化因子”。NO水平與生物活性的變化反映內(nèi)皮功能的狀態(tài)，NO功能低下與內(nèi)皮細胞的損傷過程密切相關(guān)［9］。

在人體內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸的胍基氮氧化生成NO。在血管調(diào)節(jié)功能中起決定作用的是內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)，它是NOS的一種亞型［10］。人eNOS基因位于7號染色體，共21 kb，包含26個外顯子和25個內(nèi)含子［11］。eNOS的表達水平是NO生成的決定因素，eNOS的功能降低或合成減少，會導致NO減少，不能維持正常的內(nèi)皮細胞功能，從而誘發(fā)動脈粥樣硬化［12］。

本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，同型半胱氨酸損傷模型組eNOS mRNA的表達顯著下降，其細胞培養(yǎng)液中NO水平也明顯降低;與模型組比較，丹皮酚低、中、高劑量組，eNOS mRNA表達明顯增強，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，細胞培養(yǎng)液中NO水平明顯升高。

綜上所述，丹皮酚對同型半胱氨酸損傷的HUVECs具有保護作用，從細胞水平證實丹皮酚具有抗同型半胱氨酸誘導的動脈粥樣硬化的作用。其分子機制可能為丹皮酚促進eNOS的基因表達，增加其活性，提高內(nèi)皮細胞生成的NO水平，從而對血管內(nèi)皮功能損傷有保護作用，進而對動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展有積極的防御作用。

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