劉磊，溫志超，羅心平，李劍*，施海明，范維琥

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科，上海200040;2.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院心內(nèi)科，上海200540)

丹參水溶性提取物多酚酸鹽，其主要成分丹參乙酸鎂的化學(xué)結(jié)構(gòu)已被闡明，且治療冠心病心絞痛的臨床療效已經(jīng)肯定，但具體作用機(jī)制卻報(bào)道較少。本科既往的臨床研究已提示該藥的抗心絞痛作用與抑制二磷酸腺苷(ADP)刺激引起血小板的聚集有關(guān)［1］;據(jù)此推測(cè):丹參多酚酸鹽對(duì)血小板活化能力的良性影響與血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物和顆粒膜蛋白P選擇素相聯(lián)系，而這兩項(xiàng)指標(biāo)是反映血小板活化的常用臨床指標(biāo)［2］，急性冠脈綜合癥(ACS)患者上述糖蛋白表達(dá)水平高于正常人［3］。本課題旨在從細(xì)胞水平進(jìn)一步研究ACS患者血小板表面與活性有關(guān)的糖蛋白表達(dá)，通過(guò)全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板基礎(chǔ)狀態(tài)以及ADP誘導(dǎo)活化后的PAC-1和CD62P表達(dá)比例，探明丹參多酚酸鹽對(duì)血小板活化影響的具體機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象、入選與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 研究對(duì)象2010年11月1日—2011年4月31日期間在我院確診為急性冠脈綜合癥的患者。健康志愿者為復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院招募的醫(yī)學(xué)生。

1.1.2 急性冠脈綜合癥患者入選標(biāo)準(zhǔn)年齡＞18周歲，＜75周歲;臨床首次確診為急性冠脈綜合癥，符合2007年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)和美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)關(guān)于急性心肌梗塞(AMI)及不穩(wěn)定心絞痛(UAP)的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，愿意參加本研究。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)①已經(jīng)確診ACS并經(jīng)過(guò)治療，再次發(fā)病者;②計(jì)劃給予血小板GPⅡb/Ⅲa拮抗劑或者靜脈溶拴治療者;③因其他原因長(zhǎng)期使用抗血小板或者抗凝治療者;接受中藥活血化瘀治療者;④慢性心功能不全，NYHA分級(jí)II級(jí)以上者;合并急性左心功能不全;心臟瓣膜病;⑤半年內(nèi)任何外科手術(shù)史;半年內(nèi)確診的出血性疾病史或者出血傾向;⑥嚴(yán)重肝腎功能不全;疑診或確診為惡性腫瘤;任何感染的急性期;⑦對(duì)使用丹參及中藥成分過(guò)敏者。

1.2 臨床資料的記錄采集病史、一般資料和體格檢查，根據(jù)入院先后順序分組。所有治療開始前進(jìn)行采血，收集首次血常規(guī)、肝腎功能、超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)、凝血功能;十二導(dǎo)聯(lián)心電圖和多普勒超聲左心室射血分?jǐn)?shù)，并根據(jù)結(jié)果再次進(jìn)行篩選。隨訪:治療第8天，6個(gè)月時(shí)隨訪心血管主要終點(diǎn)事件，包括死亡、復(fù)發(fā)性心梗、嚴(yán)重心衰，以電話、門診方式進(jìn)行隨訪。

1.3 分組和給藥方法本研究分為標(biāo)準(zhǔn)治療加上注射用丹參多酚酸鹽組(A組)(藥品由上海綠谷制藥有限公司提供，規(guī)格:200 mg:160 mg丹參乙酸鎂，批號(hào)091108)和標(biāo)準(zhǔn)治療組(B組)。A組給予指南建議的標(biāo)準(zhǔn)治療+注射用丹參多酚酸鹽200 mg/d，B組給予指南建議的標(biāo)準(zhǔn)治療，共7 d，第8天停用丹參多酚酸鹽，繼續(xù)給予標(biāo)準(zhǔn)治療。標(biāo)準(zhǔn)治療指根據(jù)現(xiàn)有ACC/AHA 2007年指南［4］，針對(duì)急性冠脈綜合癥的治療:包括腸溶阿司匹林和氯吡格雷(波立維)(首次分別予以300 mg頓服，次日以0.1 g/d和75 mg/d維持)、他汀類(阿托伐他汀鈣片20 mg/d)、低分子肝素(依諾肝素鈉4 000IU皮下注射，每12 h一次，共3 d)，并根據(jù)病情選擇用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)、β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑、硝酸酯類藥物，不再加用其他類中成藥物。詳細(xì)記錄患者用藥過(guò)程中的癥狀、體征。選取的急性冠脈綜合癥患者均在入院后48 h內(nèi)接受冠狀動(dòng)脈造影檢查。

1.4 患者標(biāo)本采集及處理兩組患者均采血兩次，首次在入院后即刻(抗血小板治療前)，以及治療后第8天清晨采血。使用1∶6枸櫞酸鈉抗凝管，于肘正中靜脈用粗針頭抽取兩管血共4 mL，第二管進(jìn)行聚集率和全血法流式細(xì)胞儀檢測(cè)(第一管可作它用)，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，避免強(qiáng)烈振蕩。用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)的血樣在床邊進(jìn)行預(yù)處理。

1.5 血小板功能測(cè)定

1.5.1 血小板聚集率檢測(cè)血樣采集后立即離心提取血小板，重懸在Hepes-Tyrode緩沖液(137 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，3.7 mmol/L KCl，5.6 mmol/L葡萄糖，1 g/L BSA，3.3 mmol/L NaH2PO4和20 mmol/L Hepes)中。10 min內(nèi)送檢，用比濁法置入血小板雙通道聚集儀中分析。在37℃恒溫下加入誘導(dǎo)劑，血小板聚集率以百分比計(jì)。誘導(dǎo)劑分別為二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、膠原(COL)(購(gòu)自Sigma公司)，其終濃度分別為10 μmol/L、0.5 mmol/L和2 μg/mL。

1.5.2 全血法流式細(xì)胞儀檢測(cè)［5］三色流式分析法血小板活化檢測(cè)試劑:CD42b-APC抗體;PAC-1-FITC及其對(duì)照同型大鼠免疫球蛋白抗體;CD62p-PE及其對(duì)照同型大鼠免疫球蛋白抗體;均購(gòu)自Santacruz公司。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)提前避光分裝熒光抗體，病房采血后床邊進(jìn)行全血稀釋和抗體孵育。人工活化血小板使用終濃度10 μmol/L的ADP。具體步驟如下:取出30 μL全血，加入Hepes-Tyrode緩沖液稀釋至300 μL;每一標(biāo)本取流式管A、B，均加入稀釋全血10 μL;A管:PAC-1(FITC標(biāo)記)、CD62p(rPE標(biāo)記)、CD42b(APC標(biāo)記);B管:PAC-1同型、CD62p同型、CD42b;在FLl的補(bǔ)償管中，加入FITC-IgM、PE-CD62P及CD42b單抗。在FL2的補(bǔ)償管中，加入F1TC-PAC-l、PE-IgGl及CD42b單抗。室溫避光孵育15min;最后加入1%多聚甲醛固定，置于4℃避光保存，30 min內(nèi)于華山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，Becton Dickinson)上檢測(cè)。血小板PAC-1及CD62p含量以其陽(yáng)性血小板百分率表示。

1.5.3 血小板胞漿內(nèi)鈣釋放測(cè)定［6］Fluo3/AM(鈣離子熒光探針)以及F127均購(gòu)自美國(guó)Biotium公司，1 mg Fluo3/AM溶解于含有20%F127的二甲亞砜(DMSO)溶液，配制為1 mmol/L貯備液。健康志愿者抗凝全血離心分離得血小板。用無(wú)鈣清洗液洗滌1次并配成2×108mL的血小板懸液，分別加入終濃度為2 μmol/L的Fluo3/AM，避光置37℃孵育20 min，然后用無(wú)鈣清洗液洗滌2次，用含0.5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)的Tyrode緩沖液配成血小板懸浮液。負(fù)載血小板懸液加入丹參多酚酸鹽孵育5 min后加入ADP(終濃度10 μmol/L)，在日立F4500熒光分光光度儀上進(jìn)行檢測(cè)，使用生理鹽水作為空白對(duì)照。固定發(fā)射波長(zhǎng)于527 nm，激發(fā)波長(zhǎng)分別固定在506 nm，記錄Fluo3在激發(fā)波長(zhǎng)506 nm處的熒光強(qiáng)度比值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)使用SPSS17.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用配對(duì)的t檢驗(yàn)或方差分析;非正態(tài)分布的計(jì)量資料以四分位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料的比較本研究截至2011年4月31日，共納入病例70人，占同期華山醫(yī)院心內(nèi)科確診急性冠脈綜合癥患者的27%，研究過(guò)程中因死亡剔除4人，失訪3人。最后完成兩次采血并入選的患者為63人;其中A組32人，B組31人，平均年齡(66±10)歲;男性43人(占68.2%)，女性20人(占31.7%)(見(jiàn)表1)。主要生化指標(biāo)及參數(shù):治療后兩組部分凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶原時(shí)間(APTT)以及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)無(wú)顯著差異;治療后A組hs-CRP低于B組(P＜0.05);治療后8 d，A組左室射血分?jǐn)?shù)高于B組(P＜0.05)(見(jiàn)表2)。

表1 各組患者臨床基線特征的比較Tab.1 Com parison of baseline clinical characteristics w ithin each group

表2 兩組治療前后凝血功能、Hs-CRP、EF值比較Tab.2 Comparison of the variation of coagulation，Hs-CRP and EF value between two groups before and after treatment

2.2 血小板功能檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 血小板聚集率治療前A、B兩組患者血小板最大聚集率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療后，在誘導(dǎo)劑ADP的作用下，A組血小板最大聚集率低于B組(49.20±6.12)%比(53.39±6.32)%，P＜0.05;在誘導(dǎo)劑AA的作用下，A、B兩組比較最大聚集率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(44.96±20.40)%比(45.75±12.89)%，P＞0.01;在誘導(dǎo)劑COL的作用下，A組最大聚集率低于B組(46.52±6.36)%比(49.47±4.45)%，P＜0.05(見(jiàn)圖1)。

圖1 治療后兩組患者血小板最大聚集率組間比較Fig.1 Comparison of the variation of p latelet aggregation rate between two groups after treatment

2.2.2 血小板靜息狀態(tài)糖蛋白表達(dá)治療前，兩組基礎(chǔ)狀態(tài)血小板糖蛋白比例分別為PAC-1:A組(10.16±6.46)%;B組(9.69±3.93)%。CD62P:A組(7.03±3.47)%;B組(7.76±2.80)%，組間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療后兩組糖蛋白比例均較治療前下降，分別為PAC-1:A組(6.24±2.83)%;B組(5.54±1.38)%。CD62P:A組(4.52±2.34)%;B組(4.74±1.66)%，組間比較兩組沒(méi)有顯著差異。

2.2.3 血小板活化狀態(tài)糖蛋白表達(dá)使用ADP誘導(dǎo)血小板活化，治療前兩組糖蛋白的比例分別為PAC-1:A組(71.82±12.66)%;B組(69.87±8.03)%。CD62P:A組(58.97±13.46)%;B組(60.02±10.53)%，組間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療后，A組血小板PAC-1表達(dá)比例低于B組(47.05±10.04)%比(52.18±6.18)%，P＜0.05，A組血小板CD62P表達(dá)低于B組(39.48±8.33)%比(45.04±6.68)%，P＜0.01，見(jiàn)圖2。

2.2.4 血小板胞漿內(nèi)鈣釋放血小板與質(zhì)量濃度為200 mg/L的丹參多酚酸鹽孵育后，與未干預(yù)的血小板進(jìn)行比較，高濃度的丹參多酚酸鹽不能完全抑制ADP作用于P2Y1受體引起的胞漿內(nèi)鈣釋放(見(jiàn)圖3)。

圖2 兩組患者治療前后ADP誘導(dǎo)血小板活化PAC-1、CD62p表達(dá)Fig.2 Comparison of the variation of platelet glycoprotein between two groups before and after treatment

圖3 血小板胞漿內(nèi)鈣釋放Fig.3 Effect on ADP-induced［Ca2+］i mobilization in platelets

2.3 終點(diǎn)事件在整個(gè)治療以及隨訪過(guò)程中，兩組患者均未再發(fā)心肌梗死;A組有2例患者出現(xiàn)嚴(yán)重心衰，B組共有6例患者出現(xiàn)嚴(yán)重心衰;A組死亡患者1例，B組3例。

3 討論

丹參治療冠心病的歷史悠久且療效確切，近十年來(lái)，中科院上海藥物研究所的科研人員發(fā)現(xiàn)丹參水溶性有效成分中以丹參乙酸鎂為主的丹參多酚酸鹽(含丹參乙酸鎂＞60%～80%)，在丹參保護(hù)心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［7］。本研究中觀察到，所有患者對(duì)丹參多酚酸鹽耐受良好，臨床癥狀明顯改善，血常規(guī)、肝腎功能指標(biāo)穩(wěn)定。在試驗(yàn)過(guò)程中A組與B組的患者未報(bào)告出血不良事件，未發(fā)生自發(fā)血尿、嘔血等出血事件。通過(guò)治療后比較兩組患者凝血功能指標(biāo)，兩組差異不顯著，說(shuō)明在標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上加用丹參多酚酸鹽沒(méi)有增加患者的出血風(fēng)險(xiǎn)。

既往的資料大部分來(lái)源于穩(wěn)定型心絞痛患者的臨床研究，本研究中我們選取了血小板異?；罨募毙怨诿}綜合癥患者作為研究對(duì)象，并采用不同的激動(dòng)劑刺激來(lái)觀察加用丹參多酚酸鹽治療后，患者血小板表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物和P選擇素表達(dá)的變化。血小板糖蛋白受體是血小板黏附到血管壁的成分和血小板間相互作用的關(guān)鍵物質(zhì)，其中纖維蛋白原受體GPⅡb/Ⅲa是血小板膜上最豐富的受體，各種刺激血小板聚集的物質(zhì)與各自受體結(jié)合后，都必須經(jīng)血小板GPIIb/IIIa受體與纖維蛋白原配體結(jié)合才能引起血小板聚集，為血小板聚集的最終途經(jīng)［2］。P選擇素是選擇素家族的一員，它只能在脫顆粒的血小板表面表達(dá)，介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞間的黏附，啟動(dòng)血栓形成的全過(guò)程，可作為血小板活化的分子標(biāo)志物之一［2］。在治療后，我們觀察到兩組患者基礎(chǔ)狀態(tài)PAC-1以及CD62P的表達(dá)比例均較治療前下降;而用ADP刺激血小板活化后，組間比較PAC-1以及CD62P的表達(dá)比例，發(fā)現(xiàn)治療組低于對(duì)照組(PAC-1:P＜0.05和CD62P:P＜0.01)，說(shuō)明丹參多酚酸鹽抑制了急性冠脈綜合癥患者血小板聚集最終途徑重要糖蛋白表達(dá)。我們還發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)劑ADP和膠原的作用下，治療組患者治療后血小板最大聚集率低于對(duì)照組，而膠原與血小板內(nèi)源性的ADP釋放有關(guān)［8］，提示丹參多酚酸鹽可能具有潛在的影響血小板ADP受體后信號(hào)通路的能力。ADP是體內(nèi)重要的誘導(dǎo)血小板聚集的物質(zhì)，以P2Y12受體為靶點(diǎn)的抗血小板藥的研究一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［9］。血小板的兩種主要ADP受體有著各自的功能與作用機(jī)制，P2Y12受體激活時(shí)抑制腺苷酸環(huán)化酶活性并降低環(huán)磷酸腺苷濃度;P2Y1受體的激活與Gq蛋白偶聯(lián)，通過(guò)磷脂酰肌醇的水解引起胞內(nèi)貯存Ca2+的釋放和血小板聚集，血小板的正常功能必須有兩種受體的共同參與［10］。本研究中使用單波長(zhǎng)鈣熒光指示劑Fluo3，通過(guò)EGTA螯合血小板懸液中的外鈣，測(cè)定在ADP刺激后P2Y1信號(hào)通路下胞漿內(nèi)鈣釋放情況，發(fā)現(xiàn)高于體內(nèi)有效血藥濃度［11］的丹參多酚酸鹽也不能完全抑制內(nèi)鈣釋放，提示該藥物的主要抗血小板途徑可能是通過(guò)影響P2Y12信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的［12］。

早期動(dòng)物研究提示水溶性丹參組份能減低LDLR(-/-)小鼠CRP，減輕炎癥環(huán)境［13］，與我們本次研究中觀察到丹參多酚酸鹽對(duì)患者Hs-CRP水平的影響是一致的。由于血小板參與了炎癥反應(yīng)，而抗血小板治療可降低血清CRP水平［14］，所以丹參多酚酸鹽抗炎作用可能也是建立在其抗血小板作用基礎(chǔ)之上。研究中我們還觀察到兩組患者治療后EF值均較治療前升高，但治療組患者心功能改善優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，提示治療組患者心功能有提前恢復(fù)的趨勢(shì)，這可能與丹參多酚酸鹽減輕心肌耗氧量以及擴(kuò)張血管作用有關(guān)［15］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明，抗血小板治療可以減輕急性心肌梗死引起的缺血以及再灌注損傷［16］，縮小梗死范圍，改善心功能。

本研究提示:以丹參乙酸鎂為主要成分的丹參多酚酸鹽，對(duì)急性冠脈綜合癥的療效與改善血小板功能有關(guān)，其對(duì)血小板的作用環(huán)節(jié)主要在P2Y12受體后信號(hào)通路上。丹參多酚酸鹽對(duì)血小板P2Y12受體信號(hào)通路的具體作用可能是單靶點(diǎn)，也可能存在多靶點(diǎn)的作用，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步證實(shí)。

［1］顏萍，羅心平，施海明，等.丹參多酚酸鹽對(duì)血小板功能影響的臨床研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，14(16):2092-2094.

［2］Carr M E Jr.In vitroassessment of platelet function［J］.Transfus Med Rev，1997，11(2):106-115.

［3］Flores NA，Sheridan D J.The pathophysiological role of platelets during myocardial ischaemia［J］.Cardiovasc Res，1994，28(3):295-303.

［4］Anderson J L，Adams C D，Antman E M，et aL.ACC/AHA 2007 guidelines for the management of patients with unstable angina/non ST-elevation myocardial infarction:a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines［J］.Circulation，2007，116(7):e148-304.

［5］Shattil S J，Cunningham M，Hoxie J A，et al.Detection of activated platelets in whole blood using activation-dependent monoclonal antibodies and flow cytometry［J］.Blood，1987，70(1):307-315.

［6］Merritt J E，McCarthy S A，Davies M P，et al.Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+in platelets and neutrophils.Loading cells with the dye，calibration of traces，measurements in the presence of plasma，and buffering of cytosolic Ca2+［J］.Biochem J，1990，269(2):513-519.

［7］王逸平，宣利江.中藥現(xiàn)代化的示范性成果—丹參多酚酸鹽及其注射用丹參多酚酸鹽的研究與開發(fā)［J］.中國(guó)科學(xué)院院刊，2005，20(5):377-380.

［8］Sangkuhl K，Shuldiner A R，Klein T E，et al.Platelet aggregation pathway.Pharmacogenet Genom，2011，21(8):516-521.

［9］Cattaneo M.Molecular defects of the platelet P2 receptors［J］.Purinergic Signal，2011，7(3):333-339.

［10］Jin J，Kunapuli S P.Coactivation of two different G protein-couped receptors is essential for ADP-induced platelet aggregation［J］.Proc Natl Acad Sci，1998，95(14):8070-8074.

［11］高蕊，王書臣，張穎，等.丹參多酚酸鹽臨床藥動(dòng)學(xué)對(duì)臨床試驗(yàn)的指導(dǎo)意義［J］.中藥新藥與臨床藥理，2006，17(3):226-228.

［12］Hoylaerts M F，Oury C，Toth-Zsamboki E，et al.ADP receptors in platelet activation and aggregation［J］.Platelets，2000，11(6):307-309.

［13］Zhang Q，Chang Z，Yang J，et al.Antiatherogenic property of triterpenoids-enriched extract from the aerial parts of Salvia miltiorrhiza［J］.Phytother Res，2008，22(8):1040-1045.

［14］Chew D P，Bhatt D L，Robbins M A，et al.Effect of clopidogrel added to aspirin before percutaneous coronary intervention on the risk associated with C-reactive protein［J］.Am J Cardiol，2001，88(6):672-674.

［15］陳維中，陳大貴，焦勇.丹參素對(duì)麻醉犬血流動(dòng)力學(xué)的影響［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2010，28(3):173-176.

［16］Barrabés JA，Inserte J，Mirabet M，et al.Antagonism of P2Y12 or GPIIb/IIIa receptors reduces platelet-mediated myocardial injury after ischaemia and reperfusion in isolated rat hearts［J］.Thromb Haemost，2010，104(1):128-135.