孫鳳岐 孫曉磊

摘要：本文敘述了凝膠色譜法測定頭孢菌素中高分子雜質(zhì)心得。

關鍵詞：抗生素實驗準備凝膠色譜柱操作方法

抗生素類藥物中的高分子雜質(zhì)是指藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)，分子量一般在1000～5000，個別可至10000道爾頓左右。頭孢菌素類藥物中的高分子雜質(zhì)主要成分為蛋白（多肽）類雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)兩類，前者主要來自生產(chǎn)過程的殘留或污染，后者主要是抗生素在生產(chǎn)、貯存和使用條件下發(fā)生的分子間的聚合反應產(chǎn)物。國內(nèi)外大量的實驗及臨床研究證明，抗生素所致的速發(fā)型過敏反應和其中的高分子雜質(zhì)有關，其含量對藥品的質(zhì)量有很大影響。

為提高藥品純度，減少不良反應的發(fā)生，頭孢菌素類品種中高分子雜質(zhì)的含量，獲得很好效果。

(1)儀器與實驗準備。儀器。采用液相色譜儀測定抗生素高分子雜質(zhì)含量時，液相色譜儀部分應按國家技術監(jiān)督局國家計量檢定規(guī)程匯編中 實驗室液相色譜儀檢定規(guī)程“（JJG705-90）”的規(guī)定作定期檢定，應符合規(guī)定。儀器的具體使用應詳細參閱各操作說明書。

采用自行配置的簡易儀器或系統(tǒng)應包括輸液單元、檢測單元和記錄及數(shù)據(jù)處理單元三部分。其中輸液單元應能在實驗過程中提供1m1/min左右穩(wěn)定的流速，檢測單元應具備滿足標準規(guī)定波長在內(nèi)的紫外檢測能力，同時檢測單元應能向記錄單元（色譜工作站或積分記錄儀）輸出模擬信號，以進行數(shù)據(jù)的記錄和處理。自行配置的儀器系統(tǒng)可以參照液相色譜儀的檢測規(guī)定，擬定自檢規(guī)程和能達到的技術指標，并定期檢定，以保證實驗的重現(xiàn)性。

(2)凝膠色譜柱準備。色譜柱體積規(guī)格的選擇應根據(jù)儀器系統(tǒng)的最大進樣能力、所分析樣品的溶解能力和檢測限度要求綜合考慮。通常凝膠色譜柱的載樣能力（體積）小于柱床體積的2%。一般頭孢菌素抗生素高分子雜質(zhì)測定的柱床體積應為60m1以上。

玻璃柱管的分端。開口的玻璃柱管可以采用玻璃棉加開口橡膠塞封端，或者在一端燒結石英過濾板，也可以直接購買帶調(diào)節(jié)頭的商品玻璃柱管。

凝膠介質(zhì)。凝膠色譜法可選用的凝膠有多種，目前中國藥典中抗生素高分子雜質(zhì)測定時多采用葡聚糖凝膠SephadeXG10.Sephade XG10通常為干粉，用前需用水充分溶脹。每1g SephadeXG10干粉溶脹后的柱床體積約2-3m1,可以根據(jù)需要填制的凝膠柱柱床體積計算SephadeXG10干粉的用量。溶脹采用蒸餾水浸泡，可在4℃冰箱中放置48小時，也可在水浴中煮沸一小時，以保證溶脹充分。在兩種溶脹方式中，均應隨時攪拌出去氣泡，如有必要還可進一步真空脫氣。

裝柱。將溶脹好的凝膠介質(zhì)用蒸餾水懸浮，靜置后，每次傾去上層液，以去除凝膠碎屑和雜質(zhì)。如此洗滌次數(shù)，直至上層精置液澄清為止。

可將凝膠介質(zhì)用水制成70%（V/V）DE 懸漿，一次倒入垂直放置的玻璃柱管，待凝膠顆粒沉降完畢后即完成裝柱。也可在垂直放置的玻璃柱管和漏斗，放開柱管下口，保持液流順暢，用滴灌逐管從漏斗中加入凝膠懸漿，讓凝膠顆粒在蒸餾水中緩慢沉降，注意讓漏斗中隨時保持一定的凝膠懸漿。此法裝柱時間較長，必要時可以在出柱口增加負壓加快裝柱時間。新填裝的色譜柱要先用水連續(xù)沖洗4～6小時，促使凝膠更緊密均勻地填充在柱管中。

凝膠柱的維護。凝膠柱應保證柱床連續(xù)、均一、平整，如發(fā)現(xiàn)凝膠收縮、變干斷層或出現(xiàn)氣泡，應將凝膠從柱管中倒出，重新裝柱。如果僅僅在柱頭發(fā)現(xiàn)少許污染或破壞，可用小勺將該部分凝膠挖掉棄去，加入少量流動相或水，用玻棒輕輕擾動凝膠面，靜置，待凝膠顆粒重新沉降后封閉柱頭即可。

凝膠柱恢復。一般測量方法中均可采用高濃度、大體積進樣提高檢測能力?？赡茉谏V柱中發(fā)生嚴重非特異性吸附，一方面可能改變凝膠色譜柱的分離機制，另一方面有可能造成柱堵塞，柱壓升高。此時應對凝膠進行恢復處理。

凝膠柱保存。溶脹的凝膠以及凝膠色譜柱可保存在0.02%的NaN3或20%的乙醇溶液中，以控制微生物的生長。

系統(tǒng)適用性實驗。系統(tǒng)適用性試驗包括下列內(nèi)容：

考察對照品測定系統(tǒng)與高分子雜質(zhì)測定系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000溶液峰的保留時間的比值、理論板數(shù)和拖尾因子，來控制對照品測定與高分子雜質(zhì)測定時儀器狀態(tài)的同一性；

以藍色葡聚糖2000的保留時間來表示高分子雜質(zhì)的保留特征，考察對照品色譜峰及高分子雜質(zhì)色譜峰與藍色葡聚糖2000溶液色譜峰保留時間的比值均應不超過某一限度，從而控制色譜柱狀態(tài)是否正常；

考察對照品溶液重復進樣后峰面積的相對標準偏差應符合規(guī)定。

(3)操作方法。樣品溶液的制備。按標準規(guī)定配制樣品溶液。由于某些高濃度抗生素溶液不穩(wěn)定，通常要求樣品溶液即溶即進。

對照溶液的制備。頭孢菌高分子雜質(zhì)含量測定，通常以樣品自身在SDS水溶液或純水中的締合物作為對照進行定量。在制備締合物時，應注意對濃度、水的純度等條件的控制，以保證締合完全。

進樣。頭孢菌素高分子雜質(zhì)含量測定對照溶液分別在不同流動相狀態(tài)下進樣，更換流動相后凝膠色譜柱應充分平衡后才能進樣。

進樣方式可以采用色譜儀自動進樣，也可以采用手動方式。兩種進樣方式均要求色譜柱端沒有死體積，以避免樣品擴散，造成峰展寬甚至影響分離。自動進樣操作可以參照有關液相色譜操作規(guī)程進行，手動進樣方式主要用于開口柱。

手動進樣方式，應凝膠面表面平整。進樣前用滴灌輕輕吸掉凝膠上的液體，保持色譜柱下端流暢，待柱內(nèi)液體剛剛降至凝膠面之下時，用定量器具精密量取規(guī)定體積的樣品溶液小心加入到色譜柱凝膠表面上，待樣品溶液剛剛降至凝膠表面以下時，吸取少量流動相沿色譜柱管內(nèi)壁緩緩加入，以洗下殘留在色譜柱管壁的樣品溶液，再從柱頂端加入一定量的流動相，并恢復流路，開始記錄進樣時間。

(4)分別記錄樣品和對照溶液的色譜圖，積分對照溶液的峰面積和樣品溶液中處于外水體積的高聚物雜質(zhì)面積，按外標法以峰面積計算樣品中高分子雜質(zhì)的含量。

(5)結果與判斷。按平行實驗的平均值作為樣品中高分子雜質(zhì)含量的最終結果，并與標準規(guī)定限度比較，作出是否符合規(guī)定的判斷。

(6)樣量分析。如果在一般高效液相色譜儀上使用凝膠柱，應將泵壓嚴格限制在1Mpa以內(nèi)。并且，由于一般高壓液相色譜管路和檢測器通路狹窄，容易堵塞，應盡量減少將出柱液連接到檢測器的時間，尤其新填充的色譜柱，應經(jīng)水或流動相充分平衡后再連接到檢測器。

通過實驗論證根據(jù)系統(tǒng)的情況進行樣量分析。