邱娜莎， 劉 暢， 嚴雅靜， 魏兆軍

（合肥工業(yè)大學 生 物與食品工程學院，安徽 合 肥 230009）

0 引 言

促咽側體素（Allatotropin，簡稱AT）是一種多功能的神經(jīng)肽，其功能包括促進保幼激素（JH）和促肌蛋白的生物合成、加速心臟搏動，抑制活性離子運輸?shù)龋?］。家蠶促咽側體素是一組結構相關的神經(jīng)肽家族的成員之一，這組神經(jīng)肽在昆蟲和其他無脊椎動物中廣泛分布。神經(jīng)肽受體的鑒定可以通過它們的生化分離、基因克隆及生物活性檢測等方法實現(xiàn)，它們通常是根據(jù)第1次被發(fā)現(xiàn)的活性來命名的，AT受體首先是在煙草天蛾中得以鑒定的［2］。

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）家族的絕大多數(shù)成員在結構上都有一個7次疏水跨膜區(qū)域，神經(jīng)肽作為配體通過結合其高親和性受體對細胞靶點起作用［3］。神經(jīng)肽結合產(chǎn)生的信號可以介導一個GTP結合蛋白（G蛋白）的激活，導致第2信使的水平的改變，反之，使靶細胞和生物物體的功能產(chǎn)生變化［4］。本文克隆了家蠶促咽側體素受體基因（Bommo－ATR），對其蛋白三維結構和跨膜結構進行預測，構建系統(tǒng)遺傳樹，并進行了mRNA的發(fā)育變化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶品種P50由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所提供，飼養(yǎng)條件（23±1）℃、每日光照14h，黑暗10h、70%～80%的相對濕度。從幼蟲5齡第1天起一直到成蟲第1天（其中包括幼蟲5齡階段7d、吐絲期3d、蛹期8d、成蟲期1d，共19d）解剖家蠶的腦－咽下神經(jīng)節(jié)復合體（Br－SG），每天解剖90頭，30個組織為一個樣品，每天取3個樣品。整個操作在冰上進行，解剖后將裝有腦－咽下神經(jīng)節(jié)復合體的EP管迅速放入－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RT－PCR

利用RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa，大連）提取家蠶Br－SG的RNA，利用cDNA第1鏈合成試劑盒（TaKaRa，大連）合成cDNA，然后BRO16F和BRO16R擴增家蠶ATR的ORF，見表1所列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，在紫外條件下，用手術刀切出目的片段，再用膠回收試劑盒（TaKaRa，大 連）連 接 到 PMD－18T 載 體 中（TaKaRa，大連），篩選陽性克隆后進行序列測定（上海生工公司，上海）。

表1 擴增家蠶ATR所用的引物序列

1.3 蛋白結構模擬

通 過 SWISS－MODEL 的 First Approach mode（簡捷模式）行蛋白質三維結構的模擬。SWISS－MODEL服務器是以用戶輸入信息的最小化為目的設計的，直接提供家蠶ATR蛋白的氨基酸序列，選擇簡捷模式，在CPHmodels 2.0 server服務器上做結構預測，得到蛋白質三維結構后，運用RASWIN軟件來看蛋白質分子的三維模型［5］。

1.4 熒光定量PCR

對于解剖所得的19d的樣品提取總RNA，使用DNase I處理除去基因組DNA后，取1μg總RNA反轉錄為cDNA（總體積25μL），取約10ng cDNA進行熒光定量PCR反應。利用純化后的PCR產(chǎn)物定量后來制作標準曲線 （含108～103個基因拷貝數(shù)）。實時熒光定量PCR反應采用熒光染料SYBR Green I（TaKaRa，大連）在Bio－rad iCycler iQ （美國伯樂公司）用0.2mL薄壁PCR管（AXYGEN，美國）進行。熒光定量PCR反應體系為20μL（2個引物各1μL，模板cDNA 1μL，SYBR Green I Real－time PCR Master Mix 10μL，雙蒸水2μL）。用iQ 5Multicocolor Real－Time PCR Detection System （Bio－Rad）程序執(zhí)行，PCR反應程序為95℃預變性3min，95℃變性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s；循環(huán)35次；熔解曲線從55～95℃，每5℃讀取一個熒光值。

本文采用以上步驟中稀釋成不同的濃度梯度的PCR回收產(chǎn)物作為已知起始拷貝數(shù)的標準品，利用Real－Time PCR測定不同稀釋梯度的CT值，進而制作成標準曲線。以拷貝數(shù)的lg值為橫坐標，以CT值為縱坐標做標準曲線，公式為：

其中，a值根據(jù)不同基因和不同PCR片段而不同。得出標準曲線后可以根據(jù)機器測定的未知樣品的CT值代入公式，得到樣品的起始拷貝數(shù)。

2 結果與分析

2.1 家蠶ATR的擴增和序列分析

以家蠶腦和咽下神經(jīng)節(jié)的cDNA作為模板，利用BRO16F和BRO16R擴增獲得的PCR產(chǎn)物電泳后條帶清晰，大小約1.3kb，與預期的結果一致，如圖1所示。

圖1 擴增家蠶ATR的ORF的PCR結果

克隆到T載體后，序列測定獲得1 254bp的序列，分析表明包含家蠶ATR的ORF的全長序列，編碼416個氨基酸，如圖2所示。本文從測定的Bommo－ATR與基因組預測的比較來看，存在5個堿基差別，但氨基酸僅有1個發(fā)生變化（即23位的H替換為Y）。

Bommo－ATR推導氨基酸序列的二級結構預測［6］表明，家蠶的ATR為7次穿膜蛋白，N－端位于胞外，C－端位于胞內(nèi)。家蠶ATR蛋白跨膜結構域預測，如圖3所示。從圖3可以看出，7個穿膜結構域（transmembrane region，簡稱TM）分別為（按照416個氨基酸的的相對位置，方向為N－端 → C－端）：75～97、110～132、147～169、190～209、237～259、299～321和331～353。Bommo－ATR的結構符合GPCR家族成員的典型特征［7］。

圖2 家蠶ATR ORF核苷酸和氨基酸序列

圖3 家蠶ATR蛋白跨膜結構域預測

進一步利用SWISS－MODEL的First Approach mode預測家蠶ATR的3D結構，如圖4所示，結果表明，家蠶ATR蛋白的3D結構包含18個螺旋，其中主要的α－螺旋有7個，與7次跨膜結構一致。

利用NJ方法，依據(jù)不同物種ATR的氨基酸序列構建的系統(tǒng)樹，如圖5所示，其中人的Orexin受體被選為外群。結果表明，家蠶的ATR與煙草天蛾的ATR關系最接近，其次與家蠶的另一個 促 咽 側 體 素 受 體 BNGR－A5［8］（GenBank NM－001134268）關系較接近，家蠶的ATR與埃及伊蚊［9］、小金蜂［10］、赤擬谷 盜［11］的 ATR 距 離較遠，這與傳統(tǒng)的系統(tǒng)關系一致［12］。

圖4 預測的家蠶ATR蛋白3D結果

圖5 基于不同昆蟲ATR氨基酸序列的系統(tǒng)樹

2.2 家蠶ATR發(fā)育變化

從家蠶5齡第1天到發(fā)蛾第2天，每天解剖腦和咽下神經(jīng)節(jié)復合體，用于分析家蠶ATR的mRNA發(fā)育變化［13－14］。本試驗通過設定不同濃度梯度的ATR基因PCR產(chǎn)物作為熒光定量PCR的標準品，制備定量的標準曲線。本試驗利用熒光定量PCR的方法最低可以檢測到103拷貝數(shù)的模板，家蠶ATR基因的標準曲線的線性擬合方程為：

其中，Y為CT；X為模板拷貝數(shù)的lg值。標準曲線在103～108之間顯示了很強的線性相關性，定量標準曲線的相關性系數(shù)為0.997 5，表明所制作的標準曲線非常理想，適合用來檢測ATR基因的拷貝數(shù)。ATR基因擴增標準曲線如圖6a所示。ATR基因熒光定量PCR反應的熔解曲線如圖6b所示。

由圖6b可看出，隨著溫度的升高，熒光信號隨之下降。這是因為溫度的升高會導致越來越多的DNA雙鏈被打開，與之結合的SYBR GreenⅡ染料也被釋放出來。熒光強度發(fā)生變化的拐點（熔點，Tm）處可以清楚地看到一個單一的峰，PTTH基因大約是在85℃，這個峰所對應的是擴增產(chǎn)物的熔解溫度。同時除了單一的峰之外，沒有雜峰，表明實驗中沒有污染、引物二聚體和假陽性現(xiàn)象。

圖6 家蠶ATR基因擴增標準曲線和熔解曲線

家蠶ATR基因發(fā)育變化如圖7所示。

圖7 家蠶Br－SG中ATR基因mRNA發(fā)育變化

從圖7可以看出，5齡幼蟲、預蛹期、蛹期和成蟲4個階段中，5齡幼蟲表達量最高，其次為蛹后期，蛹前期和成蟲階段表達量最低。5齡幼蟲第2天表達量最高，5齡1～5d持續(xù)維持較高的表達水平，化蛹后持續(xù)下降，蛹后期表達量重新升高，化蛾時急劇降低。幼蟲期ATR表達量水平較高，可能是該階段家蠶ATR與AT結合，促進分泌保幼激素（JH），從而維持幼蟲的正常發(fā)育［1］。

化蛹后表達量下降，此時變態(tài)發(fā)育占主導角色，幼蟲體態(tài)的維持被打破，與ATR表達量較低是相適應的。蛹后期表達量重新升高，可能與AT在這個時期促進成蟲肌蛋白的合成有關?；旰蟊磉_量下降，與這個時期家蠶各神經(jīng)肽表達量均較低的情況相吻合［15］。

3 結 論

本研究利用RT－PCR方法克隆了家蠶促咽側體素受體（Bommo－ATR）全長基因序列，并運用實時熒光定量PCR技術對家蠶5齡期至化蛾共19d的ATR表達量進行分析，主要結果有：

（1）家蠶ATR基因全長ORF序列為1 254bp，編碼416個氨基酸。預測的氨基酸序列的二級結構為7次跨膜蛋白，符合GPCR家族成員的典型特征。

（2）家蠶腦－咽下神經(jīng)節(jié)復合體（Br－SG）中ATR五齡1～5d持續(xù)維持較高的表達水平，化蛹后持續(xù)下降，蛹后期表達量重新升高，化蛾時急劇降低。

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