王曉娜，徐春城，溫定英，陶 雅，孫啟忠，韓海波

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100093; 4.內(nèi)蒙古草原勘察規(guī)劃院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051)

青貯飼料作為現(xiàn)代畜禽最主要的粗飼料來源，在畜牧業(yè)的發(fā)展中愈來愈受到養(yǎng)殖戶的重視，畜禽日糧營養(yǎng)價(jià)值的高低與其纖維性物質(zhì)含量高低密切相關(guān)[1-3]，按Van Soest[4]提出的洗滌纖維分析方法，飼料中的中性洗滌纖維(Neutral Detergent Fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid Detergent Fiber,ADF)可以替代傳統(tǒng)的粗纖維，較準(zhǔn)確地反映纖維的實(shí)際含量。根據(jù)薛紅楓和孟慶翔[5]的分析，由于日糧中大部分NDF來源于飼草，粗飼料來源的NDF有效性平均相當(dāng)于非粗飼料來源NDF的2倍，粗飼料的NDF對(duì)家畜生產(chǎn)性能的發(fā)揮至關(guān)重要。ADF雖然不能做為飼料纖維的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但是它為木質(zhì)素的測定奠定了基礎(chǔ)，與飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化率有較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系，且在評(píng)價(jià)飼料有效能值的過程中使用廣泛[6-8]。所以，準(zhǔn)確快速地測定青貯飼料中NDF和ADF含量對(duì)于青貯飼料質(zhì)量評(píng)價(jià)和畜牧業(yè)的發(fā)展起著舉足輕重的作用。

目前，國際上普遍采用Van Soest飼草分析法，其中，ADF的分析方法已被AOAC收錄(AOAC973.18)，但Van Soest法測定NDF的方法未被AOAC收錄[9]，這主要由于在測定NDF時(shí)，中性洗滌劑提取淀粉不徹底，尚有一定數(shù)量淀粉殘留在洗滌后的殘?jiān)?，降低了NDF的準(zhǔn)確性[10]。但通過在洗滌劑中添加一定量的耐高溫α-淀粉酶，可使這個(gè)問題得以解決[11-12]，因?yàn)槟透邷卅?淀粉酶是一種內(nèi)切淀粉酶，能隨機(jī)水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的α-1，4淀粉葡萄糖糖苷鍵，酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速降低，變成液化淀粉，水解生成糊精及少量葡萄糖和麥芽糖，進(jìn)而增加飼料中NDF 測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前，實(shí)驗(yàn)室一般采用范氏洗滌法對(duì)飼料中的ADF進(jìn)行測定，此種方法在測定時(shí)需要重新稱取樣品，測定過程中還需要保持濾器質(zhì)量不變。習(xí)慣上認(rèn)為，NDF相當(dāng)于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，而ADF則相當(dāng)于纖維素和木質(zhì)素[13]，由于NDF和ADF僅相差一種物質(zhì)，所以可以考慮采用連續(xù)洗滌法對(duì)青貯飼料的ADF進(jìn)行測定，這樣不僅減少了實(shí)驗(yàn)的繁瑣步驟，而且有效提高測定的效率。對(duì)于粗飼料ADF的測定，國內(nèi)大部分研究均采用傳統(tǒng)的范氏洗滌法[14-17]，薛紅楓和孟慶翔[12]在試驗(yàn)中使用連續(xù)洗滌法對(duì)粗飼料ADF進(jìn)行測定，并證明了此法的可行性。國內(nèi)對(duì)飼料中NDF和ADF測定過程中所使用的濾器做了大量的研究，實(shí)驗(yàn)室一般使用的熱抽濾裝置主要有玻璃坩堝、ANKOM濾袋、CAU濾袋等[18-20]。

為了準(zhǔn)確快速有效地評(píng)價(jià)青貯飼料纖維價(jià)值，本研究采用酶處理法測定不同青貯飼料的NDF，連續(xù)洗滌法測定ADF含量，并就3種濾器對(duì)青貯飼料NDF和ADF的影響進(jìn)行比較，以期為測定青貯飼料NDF和ADF含量提供可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品的選取與制備 選取采集自內(nèi)蒙古的8種不同青貯飼料，分別為全株玉米(Zeamays)青貯、干玉米秸青貯、青玉米秸青貯、甜菜(Betavulgaris)青貯、苜蓿(Medicagostiva)青貯、直穗鵝觀草(Roegneriaturzaninovii)青貯、尖葉胡枝子(Lespedezahedysaroides)青貯和全混合日糧(Total Mixed Ration,TMR)青貯(組成TMR日糧后青貯)。對(duì)青貯樣品采用四分法，縮分至200 g，粉碎后過0.425 mm分析篩，樣品待用。

1.2儀器與試劑 本試驗(yàn)選取的濾器為玻璃坩堝 (型號(hào)為P2，砂芯孔徑40～60 μm)、ANKOM F57(30 μm)濾袋、CAU(20 μm)濾袋以及配套的封口機(jī)，纖維半自動(dòng)測定儀，燒杯，F(xiàn)OSS纖維測定儀。

耐高溫α-淀粉酶(α-Amylase,heat-stable)由美國Sigma公司提供，型號(hào)為A3306，推薦用量為每樣品0.1 mL。

中性洗滌劑：稱取18.61 g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，化學(xué)純)和6.81 g四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)同時(shí)放入1 000 mL燒杯中，加少量水加熱溶解后，再加30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚。稱取4.65 g無水磷酸氫二鈉，放在另一燒杯中，加少量水，微微加熱溶解后傾入第1個(gè)燒杯中，稀釋至1 000 mL，此溶液pH值范圍為6.9～7.0。

酸性洗滌劑：稱取20 g十六烷基三甲基溴化銨，溶于1 000 mL已標(biāo)定過的0.5 mol·L-1硫酸溶液中，攪動(dòng)溶解。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟

NDF測定：稱取1 g(準(zhǔn)確到1/10 000 g)樣品裝入已恒重的ANKOM F57濾袋、CAU濾袋中，封緊袋口，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每種濾袋設(shè)3個(gè)空白，將空白組和處理組分別放入3 000 mL的燒杯，每個(gè)燒杯放20個(gè)濾袋，按每個(gè)濾袋100 mL中性洗滌劑和0.5 g無水亞硫酸鈉加入燒杯，處理組每樣另外加入100 μL耐高溫α-淀粉酶。將置有冰袋的蒸發(fā)皿放在燒杯上口，將燒杯置于電熱板上，在5～10 min內(nèi)煮沸，并持續(xù)保持微沸1 h。在整個(gè)煮沸過程中，每隔10 min用玻璃棒輕輕攪動(dòng)并在燒杯壁上擠出各濾袋內(nèi)的溶液，以保證中性洗滌劑充分作用于袋內(nèi)樣品。煮沸完畢后，離火冷卻10 min，用玻璃棒將濾袋夾出并放入另一燒杯，倒掉廢液。然后用沸水少量多次反復(fù)洗滌,在洗滌過程中，要用玻璃棒擠壓濾袋，以使洗滌完全。并用pH試紙檢測，直至濾液顯示為中性，擠干余水，用20 mL(20 mL·袋-1)丙酮沖洗2次，擠干袋內(nèi)丙酮，置于105 ℃的烘箱中烘3 h，然后取出放入干燥器中冷卻30 min，稱量，直至質(zhì)量不變，并記錄數(shù)據(jù)。P2型玻璃坩堝按照FOSS儀儀器說明測定青貯飼料中NDF含量。

ADF測定：對(duì)照組按范氏洗滌法步驟進(jìn)行，即與NDF對(duì)照組的測定步驟相同，只是不添加無水亞硫酸鈉。處理組按Goering和Van Soest[21]的連續(xù)洗滌法對(duì)不同青貯飼料中ADF的含量進(jìn)行測定，即用裝有NDF殘?jiān)?種濾器繼續(xù)進(jìn)行酸性洗滌處理。

1.4數(shù)據(jù)分析 采用SAS學(xué)生版8.0軟件中的ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果

2.1洗滌劑對(duì)3種濾器質(zhì)量的影響 各種濾器直接經(jīng)中性洗滌劑和酸性洗滌劑處理后，質(zhì)量雖有增減，但是變化幅度很小(表1)，平均失重率的絕對(duì)值都小于1%。經(jīng)過添加耐高溫α-淀粉酶的中性洗滌劑以及連續(xù)洗滌法對(duì)3種濾器做空白處理后，3種濾器質(zhì)量均未受到顯著影響。因此，使用3種濾器測定青貯飼料中NDF和ADF時(shí)，可以不考慮濾器質(zhì)量的變化對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

2.2耐高溫α-淀粉酶對(duì)青貯飼料NDF含量的影響 與對(duì)照所測青貯飼料NDF結(jié)果相比，在中性洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶對(duì)不同種類青貯飼料的NDF影響不同，但是大都存在減小的趨勢，其中全株玉米青貯和TMR青貯飼料在添加耐高溫α-淀粉酶后NDF含量顯著減小(P<0.05)，尤以TMR青貯飼料變化最為顯著(表2)；耐高溫α-淀粉酶對(duì)其他青貯飼料的NDF含量無顯著影響；濾袋與淀粉酶之間對(duì)青貯飼料NDF含量的測定無顯著的交互作用(P<0.05)。

表1 洗滌劑對(duì)濾器質(zhì)量的影響

2.3不同濾器對(duì)青貯飼料NDF含量的影響 在中性洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶后，不同青貯飼料經(jīng)過3種濾器測得的NDF結(jié)果差異情況不同，但是，與其他2種濾袋相比，通過P2型玻璃坩堝進(jìn)行熱抽濾所測得的結(jié)果均存在增高的趨勢，尤其以TMR青貯飼料表現(xiàn)最為顯著(P<0.05)；其他7種青貯飼料經(jīng)3種濾器測得的結(jié)果相差不顯著；8種青貯飼料經(jīng)過ANKOM濾袋和CAU濾袋所得NDF值均無顯著差異(表2)。

2.4連續(xù)洗滌法對(duì)青貯飼料ADF測定結(jié)果的影響 與范氏洗滌法相比，連續(xù)洗滌法對(duì)ADF測定結(jié)果的影響因青貯種類不同而存在差異。除P2型玻璃坩堝測定全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料的ADF外，經(jīng)過連續(xù)洗滌法測定的ADF均存在減小的趨勢，與對(duì)照相比，苜蓿青貯飼料和尖葉胡枝子青貯飼料的ADF含量變化較為顯著(P<0.05)(表3)。連續(xù)洗滌法在測定全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料ADF時(shí)，實(shí)驗(yàn)未能完全消除P2型玻璃坩堝對(duì)NDF測定結(jié)果的影響，導(dǎo)致P2型玻璃坩堝測定的ADF結(jié)果顯著高于對(duì)照(P<0.05)，其他種類青貯飼料的ADF無顯著變化。在使用連續(xù)洗滌法測定ADF時(shí)，此法與濾器無顯著交互作用(P>0.05)，連續(xù)洗滌法與青貯種類以及青貯種類與濾器均存在顯著交互作用(P<0.05)。

表2 酶處理對(duì)不同濾器中青貯飼料NDF含量的影響

表3 連續(xù)洗滌法對(duì)青貯飼料ADF含量的影響

2.5不同濾器對(duì)青貯飼料ADF的影響 使用3種不同濾器測定不同青貯飼料NDF后，繼續(xù)進(jìn)行酸性洗滌處理。由于測定NDF時(shí)各種濾器孔徑存在不同的阻塞，全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料經(jīng)P2玻璃坩堝進(jìn)行熱抽濾后所測得的ADF值顯著(P<0.05)高于其他2種濾器的測定結(jié)果，其他種類青貯飼料經(jīng)3種濾器所測結(jié)果均無顯著差異(表3)。

3 討論

3.1酶處理對(duì)青貯飼料NDF的影響 本研究表明，測定不同青貯飼料NDF含量時(shí)，在中性洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶，只對(duì)全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料產(chǎn)生顯著影響，這主要由于全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料中高淀粉含量的玉米籽實(shí)所致。也有研究指出[11]，測定高淀粉含量玉米樣品的NDF時(shí)，必須在洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶。NDF是對(duì)植物細(xì)胞壁或纖維成分的一種測量指標(biāo)，所測得的NDF主要由不溶性的非淀粉多糖和木質(zhì)素組成。在測定高淀粉青貯飼料的NDF時(shí)，有效地去除其中的淀粉，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必需步驟，只有在中性洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶才會(huì)顯著地提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，而對(duì)于淀粉含量低的青貯飼料，添加耐高溫α-淀粉酶則會(huì)增加測定成本[22]。隋連敏等[11]在測定玉米樣品的NDF時(shí)，研究了酶量的確定，指出在分析高淀粉含量樣品的NDF時(shí)，耐高溫α-淀粉酶的適宜用量為每濾袋0.8～1.0 mL。本研究中使用的酶量與其相符，試驗(yàn)結(jié)果也說明青貯樣中的淀粉得到了充分的水解，實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性得到了提高。

3.2連續(xù)洗滌法對(duì)青貯飼料ADF的影響 本研究表明，與傳統(tǒng)的范氏洗滌法相比，苜蓿青貯飼料和尖葉胡枝子青貯飼料經(jīng)過連續(xù)洗滌法所測ADF含量顯著減??；連續(xù)洗滌法測定全株玉米青貯飼料與TMR青貯飼料的ADF含量顯著高于范氏洗滌法測定結(jié)果，這主要由于玻璃坩堝在測定這2種青貯飼料NDF時(shí)，高淀粉導(dǎo)致砂芯被堵，以致過濾困難，最終導(dǎo)致ADF結(jié)果偏高。薛紅楓和孟慶翔[12]采用連續(xù)洗滌法對(duì)玉米青貯飼料ADF進(jìn)行測定，但是未與傳統(tǒng)的范氏洗滌法進(jìn)行比較，很多學(xué)者對(duì)粗飼料中的ADF也做了大量研究[23-24]，但是采用的均是傳統(tǒng)的洗滌法，所以連續(xù)洗滌法測定青貯飼料ADF含量的可行性還有待進(jìn)一步的研究。

3.3濾器對(duì)青貯飼料NDF和ADF測定結(jié)果的影響 中性洗滌劑和酸性洗滌劑對(duì)各種濾器的質(zhì)量影響不明顯，因此在使用這幾種濾器時(shí)，可以忽略濾器對(duì)測定結(jié)果的影響，這與魏時(shí)來等[16]的研究結(jié)果相同。ANKOM濾袋和CAU濾袋是由特殊材料所制成，可耐受強(qiáng)烈化學(xué)試劑，合理的孔徑可以保證洗滌液的自由流通，從而濾器質(zhì)量不受洗滌劑的影響[5,19]。本研究表明，3種濾器測得的青貯飼料NDF和ADF值無顯著差異，但是使用P2型玻璃坩堝所測得的值卻存在情況不同的增大趨勢，尤其是在淀粉含量高的全株玉米青貯和TMR青貯飼料上體現(xiàn)最為明顯，這主要是由于樣品中含有大量的淀粉，玻璃砂鍋孔徑被堵所致。正如馮繼華等[25]所述，由于待測樣品中含有較多的樹脂、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，在抽濾分離的過程中這些細(xì)小的顆粒容易在玻璃砂芯濾板表面形成致密層，或者直接堵住濾板細(xì)孔，阻礙過濾過程，明顯延長過濾時(shí)間，甚至難以過濾，導(dǎo)致測定失敗。薛紅楓和孟慶翔[12]比較了這3種濾器對(duì)飼料樣品NDF和ADF測定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)ANKOM濾袋和CAU濾袋對(duì)飼料樣品中NDF和ADF的測定結(jié)果的相似系數(shù)(R2)均為0.996，玻璃坩堝與其他2種濾袋的相似系數(shù)也很高，這主要是由于試驗(yàn)中所使用的玻璃坩堝型號(hào)以及試驗(yàn)樣品與本研究不同，關(guān)于P2型玻璃坩堝在測定青貯飼料中NDF和ADF試驗(yàn)的可行性，仍需大量試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

ANKOM濾袋和CAU濾袋適用于內(nèi)蒙古地區(qū)常見青貯飼料NDF和ADF含量的測定，對(duì)于淀粉含量高的青貯飼料，需要在測定過程中進(jìn)行酶處理以提高測定的準(zhǔn)確性，在使用玻璃坩堝測定高淀粉含量的青貯飼料時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待。連續(xù)洗滌法對(duì)苜蓿青貯飼料和尖葉胡枝子青貯飼料的影響較為顯著，對(duì)其他種類青貯飼料的ADF含量無顯著的影響，其原因仍有待進(jìn)一步研究探討。

[1]馮仰廉.反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2004:307-319.

[2][美]國家科學(xué)研究委員會(huì).奶牛營養(yǎng)需要[M].孟慶翔，譯.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002:45-50.

[3]Fox D G,Sniffen C J,Connor O J D,etal.A net carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets:Ⅲ.Cattle requirements and diet adequacy[J].Journal of Animal Science,1992,70:3578-3596.

[4]Van Soest P J.Use of detergents in the analysis of fibrous feeds.I.Preparation of fiber residues of low nitrogen content[J].Journal of the Association of Official Analytical Chemists,1963(46):825-829.

[5]薛紅楓,孟慶翔.奶牛中性洗滌纖維營養(yǎng)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2007(19):454-458.

[6]吳秋玨,徐延生.碳水化合物及其在反芻動(dòng)物飼養(yǎng)中的應(yīng)用研究[J].當(dāng)代畜牧,2006(10):21-23.

[7]張吉鹍,盧德勛,劉建新,等.粗飼料品質(zhì)評(píng)定指數(shù)的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2004,21(9):55-60.

[8]劉彩霞,王康寧.用中性、酸性洗滌纖維及粗纖維預(yù)測豬飼料消化能值的比較[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2000,13(增刊):51-56.

[9]美國公職分析家協(xié)會(huì).AOAC分析方法手冊[M].曲孝慈，譯.北京：北京大學(xué)出版社，1988:300-305.

[10]蔣永清.纖維性物質(zhì)分析方法的演變[J].國外畜牧學(xué)——飼料,1994(6):32-33.

[11]隋連敏,張麗英,李德發(fā),等.淀粉酶用量對(duì)玉米樣品中性洗滌纖維測定結(jié)果影響的研究[J].飼料工業(yè),2002,23(10):26-27.

[12]薛紅楓,孟慶翔.不同方法測定反芻動(dòng)物飼料NDF和ADF和木質(zhì)素含量的比較[J].中國畜牧雜志,2006,42(19):41-45.

[13]吳秋玨,徐延生.飼料中纖維的定義分類和功用[J].當(dāng)代畜牧,2007(1):24-25.

[14]李慧玲,郭振華,牛昌奎.制樣方法對(duì)粗飼料中NDF和ADF測定值的影響[J].牧草飼料,2010(3):97-99.

[15]閆貴龍,曹春梅,刁其玉,等.不同季節(jié)對(duì)青貯窖中全株玉米青貯品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,41(5):557-563.

[16]魏時(shí)來,藺淑琴,李典芬,等.飼糧樣品粉碎粒度對(duì)ADF和NDF尼龍濾袋法測定值的影響[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(4):3-5.

[17]余汝華,趙麗華,莫放,等.玉米秸稈青貯飼料中NDF和ADF含量變化規(guī)律的研究[J].飼料工業(yè),2003,24(10):19-20.

[18]吳秋玨,張曉慶,郝正里.用尼龍濾袋測定飼料中粗纖維的試驗(yàn)研究[J].飼料工業(yè),2005,26(1):55-56.

[19]張麗英,王宗義,李德發(fā).濾袋技術(shù)在飼料纖維分析中的應(yīng)用[J].飼料工業(yè),2001,55(5):9-10.

[20]藺淑琴,魏時(shí)來,李典芬,等.不同濾器對(duì)粗飼料中NDF和ADF測定結(jié)果的影響[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(5):24-26.

[21]Goering H K,Van Soest P J.Agriculture Handbook[M].Washington D C:ARS USDA,1970，397:1-12.

[22]彭鍵.日糧纖維定義、成分、分析方法及加工影響[J].國外畜牧學(xué)——豬與禽,1999(4):8-11.

[23]馬春暉,夏艷軍,韓軍,等.不同青貯添加劑對(duì)紫花苜蓿青貯品質(zhì)的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,9(1):128-133.

[24]玉柱,魏馨,于艷東,等.添加劑對(duì)尖葉胡枝子青貯發(fā)酵品質(zhì)及體外消化率的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(5):73-79.

[25]馮繼華,曾靜芬,陳茂春.應(yīng)用Van Soest法和常規(guī)法測定纖維及木質(zhì)素的比較[J].西南民族學(xué)院學(xué)報(bào),1994,20(1):55-56.