張里程 綜述，唐佩福 審校

骨折后早期血腫與骨折愈合機(jī)制研究進(jìn)展

張里程 綜述，唐佩福 審校

骨折愈合;血腫;免疫細(xì)胞;細(xì)胞因子

骨折愈合是一個(gè)涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞因子協(xié)同作用的復(fù)雜過程［1］，根據(jù)組織學(xué)特點(diǎn)分為炎性反應(yīng)期、軟骨痂形成期、硬骨痂形成期及骨痂重塑期。骨折后早期血腫標(biāo)志炎性反應(yīng)期開始，其內(nèi)含多種免疫細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子，對(duì)于骨折愈合至關(guān)重要［2－5］。研究表明清除骨折后血腫將導(dǎo)致骨折延遲愈合或不愈合，而皮下輸注骨折后血腫則具有成骨作用［3，4］。盡管血腫對(duì)于骨折愈合的重要性不言而喻，但其詳細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍不清晰。因此，深入解析血腫及其內(nèi)細(xì)胞、細(xì)胞因子體液成分在骨折愈合中的作用，對(duì)促進(jìn)骨折愈合、防止延遲愈合或不愈合等并發(fā)癥有重要意義。筆者就骨折后早期血腫內(nèi)各種組分與骨折愈合關(guān)系及相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 骨折后早期血腫的意義

骨折發(fā)生時(shí)，不但骨、骨膜及周圍軟組織結(jié)構(gòu)被破壞，同時(shí)還損傷骨折處血管造成出血，導(dǎo)致富含外周血細(xì)胞、免疫細(xì)胞及干細(xì)胞的血腫形成。盡管早在20世紀(jì)初，組織學(xué)研究證明了骨折后血腫對(duì)于保障骨折愈合的重要性，然而在臨床工作中常常忽視其存在。在治療開放骨折時(shí)，為減少感染風(fēng)險(xiǎn)，通常采取反復(fù)灌洗和清創(chuàng);甚至閉合骨折也鮮有考慮血腫有骨折愈合作用，血腫常被清除。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨折后第2天及第4天時(shí)清除骨折血腫或者骨折后第1天及第2天進(jìn)行徹底清創(chuàng)將導(dǎo)致骨折延遲愈合或者不愈合，并且研究還發(fā)現(xiàn)，骨折后血腫誘導(dǎo)成骨能力隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，骨折后第2天血腫僅能在鄰近骨膜的協(xié)助下產(chǎn)生成骨作用，而骨折后第4天血腫輸注到肌肉組織中具有直接成骨作用［2，3］。上述研究提示骨折后第2天血腫內(nèi)含有的成骨細(xì)胞因子，可能是其促進(jìn)骨膜成骨原因，這一點(diǎn)也通過骨折后血腫上清液的骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)［6，7］;而骨折后第4天血腫內(nèi)不僅含有細(xì)胞因子，而且含有成骨潛能干細(xì)胞;這一點(diǎn)在Oe等［8，9］研究中得到直接證實(shí)，研究者在成熟血腫內(nèi)分離出具有多分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且在特異性細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子作用下，定向分化為成骨及成軟骨細(xì)胞。該研究結(jié)果也提示在較成熟的血腫期，骨折愈合過程已經(jīng)啟動(dòng)，并且發(fā)揮著重要作用。

2 血腫內(nèi)細(xì)胞成分與骨折愈合

2.1 免疫細(xì)胞成分與骨折愈合 早在20世紀(jì)70年代，研究者就發(fā)現(xiàn)外周血白細(xì)胞培養(yǎng)液能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞吸收活性，提示骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)存在聯(lián)系。隨后越來越多研究證實(shí)，骨細(xì)胞與免疫細(xì)胞都起源于骨髓，從起始、成熟到活化，存在許多共同調(diào)節(jié)因子、受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而且巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞來源于同一祖細(xì)胞，由此人們更加確信骨細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間聯(lián)系，并提出了骨免疫學(xué)概念［10］。研究證明骨細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系網(wǎng):其中T細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)呈雙向性，比如激活的T細(xì)胞通過表達(dá)RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞形成［6］，輔助性T細(xì)胞Th17細(xì)胞通過表達(dá) IL －17 刺激破骨細(xì)胞分化［11］，另外，CD4+、CD25+、Foxp3+T細(xì)胞還可以通過分泌 TGF－b、IL－4、IL－10抑制破骨細(xì)胞形成［12］。T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子同樣調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化及功能，比如IL－4對(duì)成骨細(xì)胞具有趨化作用，而分泌的IFN－γ同樣具有誘導(dǎo)成骨的作用［12，13］。因此，免疫系統(tǒng)及免疫細(xì)胞與骨代謝調(diào)節(jié)密不可分。

從免疫學(xué)觀點(diǎn)來看，骨折后血腫形成預(yù)示著炎性反應(yīng)的開始，而適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)對(duì)骨折愈合至關(guān)重要［14，15］。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷過程會(huì)給免疫系統(tǒng)帶來影響，骨折后早期(1～4 h)血腫內(nèi)細(xì)胞成分就會(huì)發(fā)生改變，尤其是免疫細(xì)胞成分開始增加［7］。在骨折后血腫起始階段(24 h)，大量中性粒細(xì)胞趨化至損傷區(qū)域，以其強(qiáng)大的噬菌能力，成為預(yù)防感染的保障!實(shí)驗(yàn)表明這一時(shí)期血腫內(nèi)粒細(xì)胞/單核細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的比值能達(dá)到外周血中兩倍［7］。在血腫形成的48～96 h，迎來巨噬細(xì)胞遷徙的高峰，這一細(xì)胞組分對(duì)骨折愈合非常重要，除了能吞噬消化組織細(xì)胞碎片外，同時(shí)還能分泌多種細(xì)胞因子，包括 TNF －a、IL－1、IL－6、IL －8、IL －12、TGF －b、血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子－1等，刺激成纖維細(xì)胞增殖分化、膠原蛋白及血管生成［16］。而且研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞剔除將導(dǎo)致組織愈合延遲，而補(bǔ)充巨噬細(xì)胞則能促進(jìn)膠原合成及組織修復(fù)［17］。

與巨噬細(xì)胞類似，剔除全部T淋巴細(xì)胞也會(huì)抑制組織愈合［18］。此外研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)骨折愈合具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，在骨折正常愈合時(shí)，血腫內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞成分持續(xù)下降，60 h達(dá)到最低值;而在骨折延遲愈合的血腫內(nèi)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞比例增高明顯［19］。而輔助性T淋巴細(xì)胞對(duì)骨折愈合具有促進(jìn)作用，在骨折初期(24～60 h)的血腫內(nèi)比例增高明顯［20］。因此，對(duì)T淋巴細(xì)胞選擇性剔除也會(huì)得到不同的結(jié)果:比如選擇性剔除CD8+T淋巴細(xì)胞(其主要功能亞群是細(xì)胞毒性T細(xì)胞)能促進(jìn)組織愈合，但單獨(dú)剔除活化的CD4+T淋巴細(xì)胞(輔助性T淋巴細(xì)胞)則導(dǎo)致愈合的延遲［16，21］。

2.2 干細(xì)胞成分與骨折愈合 間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能細(xì)胞，在骨折愈合過程具有重要作用。而且研究人員發(fā)現(xiàn)，在骨折6～72 h血腫內(nèi)，具有調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞能力的轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，以及成骨細(xì)胞分化晚期標(biāo)記基因SPP1表達(dá)明顯增加［1］。另外，研究者還在相對(duì)成熟血腫內(nèi)分離出具有多分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞［8］，均提示血腫內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞成分對(duì)于骨折愈合的重要意義。

血腫內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞來源于兩個(gè)部分:一是骨折過程中損傷破壞的骨髓及骨膜;二是炎性反應(yīng)期釋放的促炎性細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子對(duì)循環(huán)血中干細(xì)胞的趨化作用［4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，在趨化間充質(zhì)干細(xì)胞至骨折損傷區(qū)域過程中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF－1及其G蛋白偶聯(lián)受體CXCR－4形成的 SDF－1/CXCR －4調(diào)節(jié)軸具有核心調(diào)控作用［22，23］。在損傷區(qū)域血腫內(nèi)發(fā)現(xiàn)SDF－1表達(dá)增加，尤其是在血腫臨近骨膜部位。研究還證實(shí)在軟骨內(nèi)成骨過程中，SDF－1能特異性趨化CXCR－4表達(dá)陽(yáng)性間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入損失區(qū)域。另外，通過給予抗SDF－1抗體，或者外源性SDF－1、CXCR－4蛋白，能夠抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化，進(jìn)而影響骨折愈合，該研究不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了SDF－1/CXCR－4調(diào)節(jié)軸的重要性，而且也間接證明了間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于骨折愈合的意義。

此外研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子HIF－1能通過調(diào)節(jié)SDF－1表達(dá)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化作用［24］。另外，在間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞過程中，sFRP1(secreted frizzled related protein1)發(fā)揮重要負(fù)性調(diào)節(jié)作用［25］，主要通過canonical－Wnt信號(hào)通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨折愈合。目前sFRP1已成為促進(jìn)骨折愈合新的治療靶點(diǎn)。

3 血腫內(nèi)細(xì)胞因子成分與骨折愈合

近10年來，越來越多研究開始關(guān)注細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子在骨折愈合中發(fā)揮的作用，多達(dá)50種細(xì)胞因子、血管生長(zhǎng)因子、蛋白酶及形態(tài)發(fā)生蛋白被證實(shí)與骨折愈合過程有關(guān)，然而，關(guān)于骨折局部血腫內(nèi)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子表達(dá)及調(diào)節(jié)骨折愈合的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。

3.1 血管生長(zhǎng)因子與骨折愈合 對(duì)血腫上清液進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)pH值減低、磷酸鹽、堿性磷酸酶以及乳酸鹽水平增高，證實(shí)骨折后早期血腫內(nèi)存在缺氧表現(xiàn)［1，26］。而缺氧能誘導(dǎo)一系列血管生長(zhǎng)因子表達(dá)，其中HIF－1是低氧狀態(tài)下血管發(fā)生的核心調(diào)控因子，在血腫形成24～36 h后表達(dá)增加，并通過調(diào)節(jié)其他生長(zhǎng)因子表達(dá)，促進(jìn)血管形成。研究發(fā)現(xiàn):低氧狀態(tài)下，VEGF mRNA及VEGF受體mRNA表達(dá)水平隨著HIF－1a表達(dá)增高而增高，呈明顯的相關(guān)性［27，28］。而 VEGF是最直接的血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂素，以旁分泌或自分泌形式產(chǎn)生后，與其受體結(jié)合，通過促進(jìn)骨源性內(nèi)皮前體細(xì)胞募集、遷徙、活化與增殖，促進(jìn)血管形成［28，29］。因此，學(xué)者們認(rèn)為HIF－1a主要通過促進(jìn)VEGF表達(dá)刺激血管發(fā)生、形成。此外，HIF－1能在轉(zhuǎn)錄水平上影響HMOX1(血紅蛋白加氧酶1)，GLUT1(葡萄糖載體蛋白1)表達(dá)，而這也是HIF－1a調(diào)節(jié)血管生成的另一條通路［20］。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，骨折24～36 h后，血腫內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物vWF表達(dá)開始增加，也提示血腫內(nèi)新生血管形成啟動(dòng)［20］。而且骨折愈合延遲時(shí)，vWF、Ang1、Ang2、VEGF、CYR61、FGF2、MMP2、TIMP1 等血管生長(zhǎng)因子表達(dá)均會(huì)降低［29］。

3.2 炎性因子與骨折愈合 血腫的形成預(yù)示著炎性反應(yīng)開始，也標(biāo)志著骨折愈合啟動(dòng)。炎性細(xì)胞首當(dāng)其沖，進(jìn)入骨折血腫內(nèi)，并通過分泌細(xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)，介導(dǎo)炎性反應(yīng)作用。根據(jù)細(xì)胞因子的特性可分為:促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子;其中IL－1，IL－6，MCSF及TNFa是炎性反應(yīng)初期表達(dá)增加的促炎細(xì)胞因子，并且在趨化內(nèi)源性基質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞及血管再生過程中發(fā)揮重要作用［20］。

通過檢測(cè)不同時(shí)期血腫內(nèi)細(xì)胞因子組分，發(fā)現(xiàn)IL－1，IL－6，IL－8，MCSF及TNFa均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而在骨折血腫內(nèi)含量上升:IL－1b在4 h內(nèi)即達(dá)到峰值，IL－6在12 h內(nèi)達(dá)到最高，MCSF及TNFa均在4～24 h左右達(dá)到峰值，而IL－8則在48 h后達(dá)最高，其中IL－1b與MCSF在損傷后1～4 h增加最為迅速［20］。然而在炎性反應(yīng)開始的同時(shí)，具有抑制炎性反應(yīng)作用的細(xì)胞因子也開始表達(dá)。在血腫形成最初4 h內(nèi)，抗炎細(xì)胞因子TGF－β表達(dá)開始增加，直到2～8周時(shí)達(dá)到峰值，其表達(dá)一直貫穿于骨折愈合的早期階段［13，20］。在血腫形成24～36 h內(nèi)，抗炎性細(xì)胞因子IL－10表達(dá)水平明顯增高，并且與HIF－1a表達(dá)呈明顯的相關(guān)性［20］。并最終在血腫形成36 h后，IL－10、TGF－β等抗炎性細(xì)胞因子起主導(dǎo)作用，控制和消除組織炎性反應(yīng)，并促進(jìn)炎性反應(yīng)期向細(xì)胞增殖期轉(zhuǎn)變。急性炎性反應(yīng)期一般在24 h左右達(dá)到高峰，并且在7 d內(nèi)結(jié)束。如果促炎性細(xì)胞因子過表達(dá)(TNFα、IL－1β等)或者促炎性細(xì)胞因子/抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)失衡，將導(dǎo)致炎性反應(yīng)期延長(zhǎng)及血管化進(jìn)程的抑制，最終會(huì)影響骨折愈合過程［19］。

盡管骨折后早期血腫對(duì)于骨折愈合的重要意義已經(jīng)證實(shí)，但是血腫內(nèi)炎性反應(yīng)、免疫細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)于骨折愈合的詳細(xì)機(jī)制仍未得到充分解析。炎性反應(yīng)或炎性因子對(duì)于骨折愈合不僅僅是正性調(diào)節(jié)關(guān)系，延長(zhǎng)的炎性反應(yīng)或炎性因子過表達(dá)將給骨折愈合及血管化帶來負(fù)面影響。因此繼續(xù)深入解析骨折后早期血腫特性，并對(duì)各種免疫細(xì)胞及炎性因子的正性、負(fù)性調(diào)節(jié)骨折愈合作用進(jìn)行區(qū)分與解讀，將有助于研究及制定新的骨折治療策略，并指導(dǎo)臨床工作中對(duì)骨折后早期血腫處理，最終對(duì)促進(jìn)骨折愈合、防止延遲愈合或不愈合等并發(fā)癥有重要意義。

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R274.1

張里程，男，1982年出生。博士研究生，醫(yī)師。主要從事創(chuàng)傷骨科基礎(chǔ)與臨床工作。

100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科

唐佩福，E －mail:pftang301@126.com

(2012－03－01收稿 2012－08－11修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)