植物抗蟲轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

阮文麗，吳會會，劉樂承

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025)

植物抗蟲轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

阮文麗，吳會會，劉樂承

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025)

在介紹蘇云金芽孢桿菌(Bt)、蛋白酶抑制劑(PI)、凝集素、淀粉酶抑制劑等植物抗蟲轉(zhuǎn)基因源的基礎(chǔ)上，分析了抗蟲轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對未來的研究與應(yīng)用進(jìn)行了展望。

植物；抗蟲；轉(zhuǎn)基因；蘇云金芽孢桿菌；蛋白酶抑制劑；植物凝集素；淀粉酶抑制劑

自1983年成功獲得世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草后，轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展。在抗蟲轉(zhuǎn)基因?qū)嵺`中，目前已獲得了幾十種抗蟲轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，部分轉(zhuǎn)基因抗蟲作物已進(jìn)入大田試驗，有的已進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[1]。筆者綜述了抗蟲轉(zhuǎn)基因研究的主要進(jìn)展。

1 常用的抗蟲基因源

1.1 蘇云金芽孢桿菌

蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)屬革蘭氏陽性土壤桿菌，是一種存在于土壤中的孢子細(xì)菌。Bt在芽孢形成過程中產(chǎn)生的伴孢晶體蛋白[1]，伴胞晶體由具有高度特異性殺蟲活性的結(jié)晶蛋白組成，這種蛋白通常被稱為殺蟲結(jié)晶蛋白(ICP)或δ-內(nèi)毒素以及蘇云金桿菌毒蛋白[2]。在昆蟲幼蟲的中腸道內(nèi)借助于蛋白酶的水解，原毒素轉(zhuǎn)型為多肽分子，活化了的毒素可以與敏感昆蟲腸上皮細(xì)胞表面的特異性受體相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生一些孔道，擾亂細(xì)胞的滲透平衡，并引起細(xì)胞腫脹甚至產(chǎn)生裂解，伴隨著上述過程幼蟲將停止進(jìn)食，最終導(dǎo)致死亡[3]。Bt轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)菌內(nèi)毒素對某些害蟲表現(xiàn)出較高毒性，而對人、有益昆蟲和非目標(biāo)生物幾乎無影響[4]。

Bt殺蟲晶體蛋白分為Cry類蛋白和Cyt 類蛋白2大類。目前應(yīng)用最廣的主要是Cry類 Bt殺蟲晶體蛋白。根據(jù)殺蟲譜的不同，將Cry殺蟲基因分成7大類29個亞類[5]。轉(zhuǎn)單一Bt基因的植物抗蟲效率高，應(yīng)用廣泛。但在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)，未加改造的Bt基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)水平很低，含量是植株內(nèi)全部可溶性蛋白的0.001%以下，不能直接毒殺害蟲。因此，必需對Bt基因進(jìn)行修飾改造，以提高其在植株中的表達(dá)量及穩(wěn)定性[1]。Bt殺蟲蛋白基因產(chǎn)生作用較快較強，但是其抗蟲譜較窄，且易產(chǎn)生耐受性[6]。

1.2 蛋白酶抑制劑

蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor, PI)是一類來源于動、植物和微生物，廣泛存在于植物組織及器官中的一類天然抗蟲蛋白質(zhì)，主要分布在豆科、茄科、禾本科等植物的種子和塊莖中，其含量高達(dá)總蛋白的1%～10%。與Bt毒蛋白相比，PI具有抗蟲譜廣、對人無毒副作用以及害蟲不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點[5]。在進(jìn)化過程中，PI分子活性中心部位的氨基酸殘基的歧變速率明顯高于蛋白酶，這暗示著植物PI的作用不在于調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白酶的活性，而主要在于對抗外源蛋白酶的干擾[6]。

根據(jù)作用于酶的活性基團(tuán)不同及其氨基酸序列的同源性，PI可分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和天冬氨酰蛋白酶抑制劑。其中，絲氨酸蛋白酶抑制劑可以明顯抑制昆蟲的生長發(fā)育[7]，因為大多數(shù)昆蟲(包括大部分鱗翅目、直翅目、雙翅目、膜翅目以及某些鞘翅目)腸道內(nèi)的蛋白酶主要是絲氨酸蛋白酶；而巰基蛋白酶抑制劑則對以半胱氨酸類蛋白酶為主要消化酶的鞘翅目昆蟲的防治有價值[8]。絲氨酸蛋白酶抑制劑和巰基蛋白酶抑制劑在抗蟲譜上具有互補性。

植物PI的合成、積累、降解和誘導(dǎo)，以及昆蟲蛋白酶的合成和調(diào)控等，都會影響PI的抗蟲效果。植物生長發(fā)育過程中PI的合成是有階段特異性的，即PI只在某一生長階段合成，隨后便會被降解[9]。此外，生物或非生物因素脅迫可誘導(dǎo)PI在植物體內(nèi)的表達(dá)。

1.3 植物凝集素

植物凝集素(Lectin)是含有至少一個非催化結(jié)構(gòu)域并能可逆結(jié)合特異單糖或寡糖的一類(糖)蛋白質(zhì)[10]，存在于許多植物的種子和營養(yǎng)器官中[11]。Lectin是一類具高度特異性糖結(jié)合活性的蛋白，這是它們區(qū)別于所有其他植物蛋白的標(biāo)志[12]。從總體結(jié)構(gòu)上，Lectin可劃分為部分凝集素、全凝集素、嵌合凝集素和超凝集素4類，而按進(jìn)化和結(jié)構(gòu)相關(guān)性則可分成7個家族。

正常情況下，Lectin僅作為儲存蛋白而不表現(xiàn)任何特異活性，即行使其內(nèi)源功能；一旦植物受到微生物、昆蟲的危害，Lectin就會從植物的受害細(xì)胞釋放出來，進(jìn)入危害的消化道，與特定的糖結(jié)合引發(fā)毒性，行使其外源功能[13]。Lectin在自然界中分布非常廣泛且在植物體內(nèi)含量非常豐富，在植物不同發(fā)育階段，以不同的方式保護(hù)著植物免受病蟲害的侵害，是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分[14]。

雪花蓮凝集素(GNA)是目前已知抗蟲效果最好和應(yīng)用最廣泛的凝集素[5]。而半夏凝集素(PTA)基因在水稻、玉米、小麥、煙草、百合、苜蓿等植株上成功轉(zhuǎn)化后，對褐飛虱、二化螟、麥蚜、桃蚜等對刺吸式害蟲均表現(xiàn)出一定的抗性。因此，半夏凝集素基因是良好的外源抗蟲凝集素基因，是目前利用最成熟的首選外源基因[15]。

1.4 淀粉酶抑制劑

淀粉酶抑制劑在植物中普遍存在，但在禾谷類作物和豆科植物中分布較廣。淀粉酶抑制劑基因能抑制昆蟲消化道內(nèi)α-淀粉酶活性，使食入的淀粉無法水解，阻斷昆蟲主要能量來源，它與淀粉酶形成的EI通過生理反饋調(diào)節(jié)作用，刺激昆蟲分泌過量的消化酶，產(chǎn)生厭食反應(yīng)[16]。淀粉酶抑制劑以1∶1的分子比與昆蟲淀粉酶結(jié)合，從而抑制其活性[17]。

1.5 其他抗蟲基因源

昆蟲神經(jīng)激素是已知三大昆蟲激素的一種，它控制著昆蟲許多關(guān)鍵的生理過程，影響昆蟲的生長、變態(tài)、生殖、代謝和行為等。近年來，人們已開始在基因工程中利用昆蟲神經(jīng)激素防治害蟲[18]。如蝎子、蜘蛛、毒蜂等動物或昆蟲產(chǎn)生的毒素，可使害蟲神經(jīng)麻痹，使其失去知覺，不能取食而死亡；而且蝎子和蜘蛛產(chǎn)生的毒素一般只能專一性作用于昆蟲，而對哺乳動物無害或毒性很小。另外，昆蟲激素及有關(guān)代謝酶，如神經(jīng)膚激素和保幼激素醋酶基因轉(zhuǎn)入植物后可擾亂害蟲體內(nèi)激素平衡[19]。將昆蟲激素基因引入植物或昆蟲病毒，有可能干擾昆蟲交配或棲息習(xí)慣或干擾昆蟲的發(fā)育，從而達(dá)到控制蟲害的目的[20]。

2 抗蟲轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用

抗蟲基因在轉(zhuǎn)基因作物植株上取得了良好的應(yīng)用效果，如許多Cry蛋白、蛋白酶抑制劑和凝集素的轉(zhuǎn)基因甘蔗株系對鉆孔蟲、允吸式害蟲或蛆(蠐螬)有抗性[21]。

2.1 轉(zhuǎn)Bt基因的應(yīng)用

表達(dá)Bt內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因作物可以控制一些害蟲，并對蟲害防治水平顯著[4]。如轉(zhuǎn)Bt基因草地早熟禾植株對1～2齡棉鈴蟲均具有抗性，其棉鈴蟲幼蟲校正死亡率可高達(dá)70%以上[22]，且轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉對棉蚜發(fā)育速度、成蚜壽命、4齡若蚜體重、成蚜繁殖力差異均無顯著影響[23]；田間玉米螟對T5～T8代轉(zhuǎn)Bt基因玉米葉片、莖桿、穗部危害程度極顯著低于非轉(zhuǎn)Bt基因玉米[24]。轉(zhuǎn)CryI(c)基因和CryI IA基因的雙價抗蟲棉，不僅高抗棉鈴蟲等鱗翅目害蟲，而且還抗雙翅目等棉花害蟲[25]。目前國外已培育出含2種Bt基因的抗蟲棉新品種，并在生產(chǎn)上推廣種植[25]。

2.2 轉(zhuǎn)蛋白酶抑制劑基因的應(yīng)用

利用大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得了具有明顯抗棉鈴蟲能力的轉(zhuǎn)基因煙草[26]。研究表明，甘薯塊根中的一類貯藏蛋白sporamin蛋白有較強的胰蛋白酶抑制劑活性，而大多數(shù)植食性昆蟲的消化酶屬于胰蛋白酶類[27]，因此，植物蛋白酶抑制劑對多種昆蟲的生長發(fā)育具有抑制作用[5，28]。

2.3 轉(zhuǎn)植物凝集素基因的應(yīng)用

自雪花蓮凝集素基因被克隆以來，已經(jīng)相繼在十幾種作物中得到成功轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出一定的抗蟲性[15]。半夏凝集素粗提液對棉蚜等刺吸式同翅目害蟲致死作用顯著，是一種有重要價值的抗蟲基因[29]。Bt毒蛋白和蛋白酶抑制劑主要針對鱗翅目、直翅目、鞘翅目等咀嚼式昆蟲，而植物凝集素基因不僅對鱗翅目、鞘翅目害蟲有一定的效果，同時對蚜蟲、葉蟬和稻飛虱等同翅目吸食性昆蟲害蟲也有較高的抗性，并對一些真菌病害也有一定作用。

2.4 轉(zhuǎn)淀粉酶抑制劑基因的應(yīng)用

小麥α-淀粉酶抑制劑(WAAI)和菜豆α-淀粉酶抑制劑(BAAI)目前研究的比較多。用轉(zhuǎn)WAAI基因的煙草葉片喂養(yǎng)鱗翅目幼蟲，其死亡率增加了30%～40%[30]。轉(zhuǎn)菜豆α-淀粉酶抑制劑(α-A IPv)基因的煙草和豌對鞘翅目幼蟲的生長發(fā)育有一定的阻礙作用，目前已從小麥和大麥中克隆出該基因轉(zhuǎn)化到煙草中，能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定地表達(dá)并在種子發(fā)育過程中積累[18]。

此外，有研究表明，轉(zhuǎn)Bmk IT4(東亞鉗蝎軟癱型昆蟲毒素)基因煙草植株，對煙草天蛾、棉鈴蟲和大豆食心蟲表現(xiàn)較強的抗性，并抑制昆蟲發(fā)育[31]。

3 展望

對已克隆出的基因進(jìn)行修飾、利用高效率的啟動子調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平是轉(zhuǎn)基因技術(shù)后續(xù)的工作目標(biāo)。如豇豆胰蛋白酶抑制劑(CPTI)表達(dá)量低，經(jīng)修飾后，對轉(zhuǎn)基因煙草、棉花、油菜、馬鈴薯及水稻鱗翅目、鞘翅目及直翅目害蟲均表現(xiàn)出較好的抗蟲效果[32]。

目前轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因引用較多的是Bt加CPTI，且抗蟲效果較好。因為兩者的拮抗和增效作用均衡時，蛋白酶抑制劑可抑制腸道中阻止Bt晶體蛋白失活的某些蛋白酶，從而增加Bt晶體蛋白的毒殺活性。如雙抗蟲基因(BtCrylAc和慈姑蛋白酶抑制劑)三倍體毛白楊，舞毒蛾定期死亡率高，且延續(xù)時間較長[33]。我國已開始研究將外源凝聚素基因與CPTI基因和Bt基因結(jié)合，構(gòu)建三價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的遺傳轉(zhuǎn)化工作[34]。除開發(fā)利用動物、植物及微生物的潛在抗蟲基因外，控制或影響昆蟲重要生理代謝的基因也是一條可供選擇的途徑[20]。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.10.006

2012-09-22

阮文麗(1989-)，女，湖北武漢人，碩士生，研究方向為園藝植物生物技術(shù)。

劉樂承，E-maillchliu18@yangtzeu.edu.cn。

S435.112;Q789

A

1673-1409(2012)10-S023-04