史桂梅 鐘紅平 劉世平
銅綠假單胞菌(psedom onas aeruginas,Pa)是目前難治性醫(yī)院感染的主要致病菌,主要原因是Pa多重耐藥(multidrug-resistance,MDR)株不斷出現(xiàn)[1]。耐藥結節(jié)細胞分化家族(resistance nodulation cell division family,RND)是細菌外排泵系統(tǒng)之一,在Pa的多重耐藥中起著重要作用[2,3]。本文探討多藥耐藥Pa的9種外排泵系統(tǒng)表達的分布趨勢及其感染危險因素,為臨床防治銅綠假單胞菌多重耐藥的產(chǎn)生提供理論支持。
1.菌株來源:收集2008年1月~2010年12月筆者醫(yī)院兒科多重耐藥Pa感染病例97例。年齡為出生后7天~12歲,平均年齡7.8歲,其中痰標本37例,血標本29例,創(chuàng)面標本18例,導管標本8例,其他標本5例,菌株均經(jīng)VITEK-Am s60全自動細菌鑒定系統(tǒng)和常規(guī)生化檢測鑒定。
2.主要儀器試劑:熒光定量PCR儀、電泳儀、核酸蛋白分析儀、低溫高速離心機、凝膠成像分析系統(tǒng)。TRIzol RNA提取液,Prime Script RT reagent Kit Perfect Real time試劑盒及Premix Taq Version 2.0,ABI7500熒光定量專用96孔板,瓊脂糖,異丙醇,三氯甲烷,無水乙醇等分析純。
3.實驗方法:(1)細菌處理:收集臨床標本培養(yǎng)的多重耐藥Pa株,先用LB培養(yǎng)基搖菌增菌,后加入無菌甘油(20%終濃度),-80℃冰箱保存待用。(2)基因檢測:1)引物設計:參考文獻進行PCR引物設計,所有PCR產(chǎn)物(>150bp)進行雙向測序,所測各基因序列與Pubmed數(shù)據(jù)庫中相關基因進行Blast比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[4~8]。2)細菌總RNA提取、cDNA的合成及反轉錄反應:LB培養(yǎng)基搖菌增菌,后加入無菌甘油,-80℃冰箱保存待用。提取總RNA之前置于冰上復溫,然后接種于LB培養(yǎng)基中,240r/min,37℃振搖16~18h,取菌液3ml,4000r/min,離心3min,棄上清,加1m l TRIzol RNA提取試劑盒,按說明步驟提細菌總RNA,然后行凝膠電泳測RNA完整性,選擇3條帶清晰,A260/ A280=1.8~2.0的細菌總RNA行反轉錄反應,按試劑盒說明操作。3)PCR分析目的基因的表達:Pa菌株總cDNA進行PCR反應,每株菌均設rpsL為內(nèi)參,反應產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳,100V 5min,然后凝膠電泳成像儀拍照保存。4)realtime-PCR半定量分析目的基因的表達:反應體系:SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)10.0μl,熒光定量PCR上下游引物(10μmol/L)各1μl,ROX Reference Dye or DyeII(50×)0.4μl,RT反應液(cDNA溶液)1.0μl,滅菌雙蒸水補至20μl體系,ABI7500分析。分析方法采用2-ΔΔCT法半定量分析各基因表達量,重復3次計算結果。
1.多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥情況:具體見表1。
表1 多重耐藥Pa藥敏結果[n(%)]
2.各外排基因的表達情況:MexAB-OprM均表達(97/97),MexEF-Op rN表達陽性率51.5%(50/ 97),MexCD-OprJ為36.1%(35/97),MexVMOprM為11.3%(11/97),其他少見外排泵系統(tǒng)表達均較低,詳見圖1。
圖1 9種Pa外排泵基因表達陽性率其中3種外排泵基因高表達散點圖
3.多重外排泵基因表達分析:同時表達2種外排泵的有23株,占23.7%,MexAB-OprM與MexEFOprN組合(15株),MexCD-OprJ與MexEF-OprM組合(7株),MexXY-OprM與MexMN-OprM(1株)組合為主,未見其他組合;同時表達3種外排泵的有7株,占7.2%,主要以MexAB-OprM+MexEFOprN+MexXY-OprM組合,未見其他組合。
4.外排泵基因表達或高表達的危險因素分析:具體見表2、表3。
表2 銅綠假單胞菌主要多重耐藥外排泵表達的危險因素單因素分析[n(%)]
表3 銅綠假單胞菌3種常見多重耐藥外排泵表達或高表達的危險因素多因素Logistic回歸分析
銅綠假單胞菌隸屬非發(fā)酵菌假單胞菌屬,是一種重要的條件致病菌,也是引起院內(nèi)感染的重要病原菌[9]。Pa耐藥機制復雜,耐藥結節(jié)細胞分化家族的主動外排泵系統(tǒng)在Pa多重耐藥機制中起主導作用[10]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種Pa的外排泵系統(tǒng),不同外排泵的表達導致細菌耐藥譜各異。因此,研究各種外排泵表達的分布,對臨床抗感染治療有重要指導作用。本研究發(fā)現(xiàn),MexAB-OprM在所有多重耐藥Pa菌株中均表達,其高表達也達到44.3%,其次是Mex-EF-OprN(51.5%),MexCD-OprJ(36.1%),MexVM-OprM(11.3%),除MexJK-OprM未發(fā)現(xiàn)之外,其他外排泵表達均較低,此外還存在多種外排泵系統(tǒng)組合表達的情況。而臨床分離的敏感菌株中,除Mex-AB-OprM均低水平表達外(資料未顯示),未見其他外排泵系統(tǒng)的表達,說明各種外排泵的表達與菌株對抗生素的耐藥存在相關性,與國內(nèi)報道一致[11]。由于存在不同外排泵系統(tǒng)的組合表達,導致耐藥的復雜和廣泛化,使得臨床治療藥物選擇受限。
Pa外排泵系統(tǒng)的表達,部分是由于抗生素誘導而產(chǎn)生的。Kolayli等研究發(fā)現(xiàn)碳青酶烯類抗生素亞胺培南可以誘導Pa表達MexAB-OprM增高,但丁兆勇等[12]研究發(fā)現(xiàn)亞胺培南、環(huán)丙沙星對Pa浮游菌及生物膜菌的MexAB-OprM無誘導作用,因此需進行更大樣本的研究。本研究通過單因素危險分析發(fā)現(xiàn),糖肽類抗生素的使用可能導致MexAB-OprM的表達增高,機制不明。而碳青酶烯類抗生素及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是MexEF-OprN、MexCD-OprJ誘導表達的危險因素,考慮這些抗生素是其合適的底物,過度使用使得耐藥突變株被篩選出來而成為優(yōu)勢菌株。因此,嚴格規(guī)范這些抗生素的使用,可能會減輕Pa MexAB-OprM高表達和 MexEF-OprN、MexCD-OprJ表達,從而減輕細菌耐藥。
多重耐藥Pa外排泵基因表達的危險因素分析,發(fā)現(xiàn)碳青酶烯類和糖肽類抗生素的使用是Pa MexAB-OprM外排泵誘導性高表達的危險因素,碳青酶烯類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的使用是Pa MexEF-OprN、MexCD-OprJ外排泵誘導性表達的危險因素,提示不合理的抗生素濫用可能是誘導多重耐藥Pa外排泵基因表達的危險因素。在Pa外排泵基因表達的傳播性危險因素分析中,侵入性操作如氣管插管機械通氣、深靜脈置管和留置導尿管等、低WBC、貧血、慢性基礎疾病、入住ICU病房是Pa MexAB-OprM、MexEFOprN、Mex CD-OprJ 3種外排泵傳播性表達或高表達的共同危險因素,可能是因為侵入性操作,破壞了機體的自然免疫屏障,增加了細菌接觸機會,從而增加了耐藥菌株在不同個體之間的傳播。ICU病房環(huán)境中存在多數(shù)耐藥菌株[13],加之患兒免疫力低下及實施各種侵入性操作,極易導致周圍耐藥菌株的定植并感染。多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),碳青酶烯類抗生素的使用、侵入性操作(包括氣管插管呼吸機輔助通氣和深靜脈置管、留置尿管)、入住ICU病房是Pa 3種常見外排泵表達或高表達共同的獨立危險因素。
總之,多重耐藥銅綠假單胞菌對臨床常用抗生素耐藥嚴重,其耐藥部分是由于Pa多重耐藥外排泵表達或高表達所致。嚴格規(guī)范碳青酶烯類抗生素,大環(huán)內(nèi)酯類及糖肽類抗生素的使用、防止患兒出現(xiàn)各種導致免疫力低下的因素以及嚴格把握入住ICU病房的準入標準,減少不必要的侵入性操作對于防止Pa多藥外排泵系統(tǒng)誘導或傳播性表達的產(chǎn)生具有重要意義。
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