游建,周巖

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

在轉(zhuǎn)基因植物中,導(dǎo)入植物體內(nèi)的外源基因除了目的基因之外,還有選擇標(biāo)記基因及其他相關(guān)基因.目的基因是用來優(yōu)化或賦予植物特定性狀的基因；選擇標(biāo)記基因則能賦予轉(zhuǎn)基因植株抗某種抗生素或除草劑等特性,在轉(zhuǎn)基因過程中的使用可以大大提高轉(zhuǎn)基因植物篩選的效率.除了目的基因,人們對轉(zhuǎn)基因植物的擔(dān)憂主要集中在標(biāo)記基因上,盡管還沒有確切的證據(jù)證實(shí)標(biāo)記基因確實(shí)存在安全隱患,但標(biāo)記基因的安全性問題已受到世界各國政府和組織的重視,并已成為限制轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化發(fā)展的主要瓶頸[1].如何刪除標(biāo)記基因以提高轉(zhuǎn)基因植物的安全性一直是基因工程研究的熱點(diǎn)之一,研究人員已先后發(fā)展了如共轉(zhuǎn)化[2]、位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[3]、轉(zhuǎn)座子法[4]等手段來刪除轉(zhuǎn)基因植物中的標(biāo)記基因,從而提高基因工程中標(biāo)記基因的安全性,并已取得豐碩成果.位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng),由于其在標(biāo)記基因刪除過程中有較高的刪除效率和刪除精確性,因此在刪除轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)記基因,獲得無標(biāo)記基因作物方面發(fā)揮著重要作用[5].近年來,運(yùn)用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在去除水稻、煙草、柑橘等轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)記基因方面的研究已有大量報道[6-8].來源于啤酒酵母的FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)由于具有較高的刪除效率和刪除精確性,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于煙草、擬南芥、水稻等高等真核模式植物的研究中,實(shí)現(xiàn)了基因敲除、基因插入、點(diǎn)突變、缺失突變、染色體組大片段刪除等基因工程操作[9].本文主要就FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的基本概況及其在植物基因工程中標(biāo)記基因刪除方面的應(yīng)用進(jìn)行概述和評價.

1 FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)概況

FLP/FRT系統(tǒng)來自于啤酒酵母（saccharomyces cerevisiae）細(xì)胞內(nèi)的2 μm雙鏈環(huán)狀DNA質(zhì)粒.2 μm雙鏈環(huán)結(jié)構(gòu)上最為顯著的特點(diǎn)是存在2個9 bp的反向重復(fù)序列.由于2個9 bp的反向重復(fù)序列之間可以發(fā)生DNA片段重組,因此,酵母細(xì)胞中的2 μm雙鏈環(huán)結(jié)構(gòu)存在2種不同的可以互變的構(gòu)型,這種行為使得2 μm雙鏈環(huán)在酵母細(xì)胞中的能夠維持較高的拷貝數(shù).后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),2 μm雙鏈環(huán)分子內(nèi)發(fā)生的DNA重組屬于受特異性酶催化的位點(diǎn)特異性重組.1980年,Broach等[10]將催化這一特異性重組反應(yīng)的由flippase基因編碼的重組酶命名為“FLP”（flippase recombination enzyme）.FLP是特異性重組酶,作用的靶序列為2 μm雙鏈環(huán)的2個反向重復(fù)序列中包含有3個13 bp的FLP重組酶結(jié)合區(qū)和1個8 bp的含限制性酶切位點(diǎn)的非對稱間隔區(qū)的共48 bp的FRT位點(diǎn)（FLP recombination target）.自1993年Lyznik等[11]利用FLP/FRT系統(tǒng)瞬時轉(zhuǎn)化玉米和水稻的原生質(zhì)體以來,FLP/FRT系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于煙草、擬南芥、楊樹等高等真核模式植物的研究中,并在實(shí)踐中得到不斷的改良和發(fā)展,是目前轉(zhuǎn)基因動植物研究領(lǐng)域進(jìn)行基因操作的強(qiáng)有力的工具.FLP/FRT系統(tǒng)在植物基因工程中主要有3個方面的應(yīng)用：定點(diǎn)轉(zhuǎn)化植物、刪除標(biāo)記基因、特定組織器官或發(fā)育時期刪除轉(zhuǎn)入的外源基因[12].其中,刪除篩選標(biāo)記基因是FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的重要應(yīng)用.

2 FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在標(biāo)記基因刪除中的應(yīng)用

按照工作原理及切除過程的不同,FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)大致可劃分為3種基因刪除方式,即：簡單刪除、控制刪除及高效刪除.

2.1 簡單刪除

簡單刪除是FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)最先采用的刪除方式.研究者首先要構(gòu)建兩個載體,一個載體上構(gòu)建有FLP重組酶基因,另一個載體則構(gòu)建有2個同向的FRT序列,選擇標(biāo)記基因位于2個同向的FRT序列之間.利用構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化不同植株,獲得分別FLP重組酶基因和2個同向的FRT序列的植株,再將轉(zhuǎn)化體進(jìn)行有性雜交,后代經(jīng)分離獲得無標(biāo)記基因的植株，或者通過二次轉(zhuǎn)化的方法刪除篩選標(biāo)記基因.自從Lyznik[11]等首次利用二次轉(zhuǎn)化將FLP/FRT系統(tǒng)用于玉米和水稻的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化瞬時表達(dá)以來,許多研究者對此進(jìn)行了大量嘗試,并取得了較大成功.Kerbach等[13]于2005年通過有性雜交的方式首次將FLP/FRT系統(tǒng)引入到玉米植株中,但是在轉(zhuǎn)基因后代中檢測到的刪除效率很低,7株雜交后代僅有1株檢測到了刪除事件的發(fā)生.單曉映等[14]利用二次轉(zhuǎn)化的方法分別將兩側(cè)含有FRT位點(diǎn)的乙酰乳酸合成酶als基因作選擇標(biāo)記基因和含有由熱誘導(dǎo)啟動子hsp70控制的FLP重組酶基因轉(zhuǎn)入煙草中,獲得了煙草轉(zhuǎn)化植株,建立了可在植物中廣泛應(yīng)用的FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng).熱激處理誘導(dǎo)熱誘導(dǎo)型啟動子hsp70調(diào)控的重組酶FLP基因的表達(dá)后,獲得了41%的二次轉(zhuǎn)化植株選擇標(biāo)記基因als的有效刪除率.Hu等[6]則將構(gòu)建含有卡那霉素抗性基因（nptⅡ）和gus報告基因的水稻品系與含有編碼FLP重組酶基因的水稻品系通過有性雜交獲得了無卡那霉素抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因水稻,F1代水稻植株體內(nèi)FLP介導(dǎo)的卡那霉素抗性標(biāo)記基因刪除效率達(dá)到了25.6%,實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記基因的有效刪除.Li等[15]首先將擬南芥中能提高植物耐堿性的Na+/H+反向運(yùn)輸?shù)鞍谆駻tNHX1轉(zhuǎn)入玉米基因組,獲得了含有反向運(yùn)輸?shù)鞍谆駻tNHX1和乙酰乳酸合成酶標(biāo)記基因als的轉(zhuǎn)基因玉米.通過與轉(zhuǎn)化FLP重組酶基因的轉(zhuǎn)基因玉米雜交,雜交F1代能有效利用FLP/FRT系統(tǒng)刪除乙酰乳酸合成酶選擇標(biāo)記基因,刪除效率達(dá)到40.7%,同樣實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記基因的有效刪除.

通過二次轉(zhuǎn)化FLP重組酶基因或與轉(zhuǎn)化FLP重組酶基因的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行有性雜交從而引入重組酶基因來實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的刪除,轉(zhuǎn)化植株需要進(jìn)行自交分離篩選無重組酶基因以及轉(zhuǎn)化重組酶基因時帶入的另一個選擇標(biāo)記基因,使得無選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因后代選育周期過長.另外,二次轉(zhuǎn)化首先需要建立一個高效的遺傳再生體系.然而,對于轉(zhuǎn)基因困難的作物來說由于其較低的轉(zhuǎn)化效率,限制了二次轉(zhuǎn)化的應(yīng)用.此外,有性雜交方法也不適合無性繁殖作物.無論是二次轉(zhuǎn)化還是有性雜交的方式引入重組酶基因轉(zhuǎn)入由于其工作量大,周期長,刪除效率低,不受人為控制,標(biāo)記基因的刪除效率不高等缺陷限制了其在植物遺傳改良中的應(yīng)用.

2.2 可控刪除

通過簡單刪除方式需要通過后代自交分離進(jìn)一步去掉重組酶基因及轉(zhuǎn)化重組酶基因時所帶入的另一個選擇標(biāo)記基因,使得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物的選育周期過長,刪除效率不高,且受體范圍只局限于有性生殖的植物.針對以上不足,研究人員發(fā)展了新的標(biāo)記基因控制刪除技術(shù)即將FLP重組酶基因和目的基因、FRT位點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因等都構(gòu)建到同一個植物表達(dá)載體上,將要刪除的選擇標(biāo)記基因和FLP重組酶基因置于2個同向的FRT位點(diǎn)間,采用特異性啟動子,如化學(xué)誘導(dǎo)或熱誘導(dǎo)等誘導(dǎo)型啟動子、種子或花等組織特異性啟動子等,來啟動FLP重組酶基因的表達(dá),實(shí)現(xiàn)目的基因的刪除[16].自從Kilby等[17]首次采用大豆熱激蛋白基因啟動子Gmhsp17.6-L實(shí)現(xiàn)了對重組酶FLP基因表達(dá)的可控性誘導(dǎo)后,利用各種誘導(dǎo)型啟動子控制誘導(dǎo)重組酶基因的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記基因進(jìn)行時空可控性刪除日益受到研究人員的親睞[9].Deng等[18]利用構(gòu)建的含有置于2個同向的FRT位點(diǎn)間的重組酶FLP基因和轉(zhuǎn)錄因子基因（babyboom,BBM）的載體pLFFP-BBM轉(zhuǎn)化中國毛白楊.其中,重組酶FLP基因由熱激誘導(dǎo)啟動子HSP18.2控制，BBM由35S啟動子驅(qū)動.在毛白楊的體細(xì)胞胚胎建成過程中,BBM的過量表達(dá)使得毛白楊的體細(xì)胞胚能夠再生出表型變異的轉(zhuǎn)基因植株,經(jīng)過熱激處理誘導(dǎo)重組酶的表達(dá),使得BBM被刪除,從而植株表型恢復(fù)正常.體細(xì)胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)可以在不使用任何選擇劑的情況下,利用體細(xì)胞胚再生無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株.Woo等[19]利用多重脅迫誘導(dǎo)的過氧化物酶（POD）啟動子誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá),在附加有過氧化氫的條件下,刪除了轉(zhuǎn)基因煙草中作為選擇標(biāo)記的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶hpt基因,獲得的F1代轉(zhuǎn)基因植株中選擇標(biāo)記基因的刪除效率最高可達(dá)41%.Fladung[20]利用構(gòu)建的含有置于2個同向的FRT位點(diǎn)間大豆熱誘導(dǎo)啟動子HSP17.5-E驅(qū)動的重組酶FLP基因和35S啟動子驅(qū)動的nptⅡ基因的載體pTex轉(zhuǎn)化山楊.經(jīng)過熱激誘導(dǎo),65.2%的轉(zhuǎn)化再生植株成功地刪除了FLP和nptⅡ基因.有研究者同樣研究了FLP/FRT系統(tǒng)在楊樹遺傳改良中進(jìn)行篩選標(biāo)記基因移除和目的基因轉(zhuǎn)移中的可行性,其研究結(jié)論顯示FLP/FRT系統(tǒng)可以在楊樹中介導(dǎo)高效的篩選標(biāo)記移除和進(jìn)行精確的基因定向整合.從理論上說,由于熱激處理等誘導(dǎo)處理轉(zhuǎn)基因植物的時間和頻率都可以人為控制,故可以自由控制轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的刪除.但是,如果將其應(yīng)用于大田大規(guī)模種植的轉(zhuǎn)基因作物去解決轉(zhuǎn)基因安全性等問題,仍然存在可操作性以及刪除有效性等障礙.

在控制刪除階段,位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)利用可控制的自我刪除途徑,克服了二次轉(zhuǎn)化和有性雜交等刪除方式轉(zhuǎn)化效率不高,操作周期長等弊端,同樣適用于無性繁殖的植物,一步即可獲得目的植株,大大簡化了操作步驟,實(shí)現(xiàn)對基因靶位點(diǎn)時空上的精確調(diào)控,從而獲得無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個體,在煙草、擬南芥等雙子葉模式植物中得到了廣泛的應(yīng)用.在轉(zhuǎn)基因植物的T0代通過控制誘導(dǎo)重組酶基因的表達(dá)就可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的有效刪除,縮短了標(biāo)記基因和重組酶基因的刪除時間,避免了由于重組酶的過量表達(dá)對植物的傷害.采用可控的誘導(dǎo)型啟動子雖然克服了簡單刪除階段二次轉(zhuǎn)化和有性雜交的不足,但早期的研究中由于啟動子驅(qū)動能力不足,另外FLP重組酶表達(dá)量較小,造成刪除效率普遍較低.較低的刪除效率,尤其是單子葉植物中的較低的刪除效率,在很大程度上限制了可控刪除系統(tǒng)在獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物中的生產(chǎn)應(yīng)用.

2.3 高效刪除

高效刪除實(shí)際上是對控制刪除的進(jìn)一步改良和發(fā)展.高效刪除階段一方面通過采用啟動能力強(qiáng)的強(qiáng)啟動子如組織特異性啟動子,另一方面通過在載體中插入促進(jìn)重組酶和特異性位點(diǎn)識別或結(jié)合的序列來改進(jìn)載體構(gòu)建策略,從而提高重組酶的表達(dá)量以及與特異識別位點(diǎn)的結(jié)合能力,從而提高刪除效率.近年來,Luo等[21-23]在利用改良型的雜合loxP-FRT識別位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記基因的高效刪除與基因整合方面,進(jìn)行了大量研究.2005年,Luo等[21]采用來自于擬南芥的熱激蛋白Hsp18.2基因啟動子控制重組酶基因FLP的表達(dá),同時以GUS基因作為報告基因,抗生素抗性基因（NPTⅡ）作為篩選標(biāo)記基因,構(gòu)建了一個新的重組酶刪除系統(tǒng).該系統(tǒng)采用loxP-FRT融合識別位點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單識別位點(diǎn),將所有外源基因置于重組酶系統(tǒng)的兩個識別點(diǎn)之間,當(dāng)獲得轉(zhuǎn)基因植株后,采用熱激處理的方式啟動重組酶基因的表達(dá),迅速刪除轉(zhuǎn)基因植物中所有外源基因,獲得了高達(dá)84.9%的刪除效率.2007年,羅克明等[22]在其構(gòu)建的改良型的雜合loxP-FRT識別位點(diǎn)間加入8 bp的間隔序列融合構(gòu)成一個新的雜合識別位點(diǎn)loxP-FRT,即GM-gene-deletor,對煙草的轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果表明,以來自擬南芥的種子組織特異性啟動子PAB5驅(qū)動的重組酶Cre和FLP基因同時表達(dá)時其刪除效率在一個較低水平；當(dāng)Cre或FLP基因單獨(dú)表達(dá)時可顯著提高位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中對外源基因的刪除效率,刪除效率可達(dá)100%,并且在轉(zhuǎn)基因自交或雜交后代種子中的外源基因刪除率達(dá)到了100%,同時證明了這種刪除系統(tǒng)能在無性生殖后代中得到穩(wěn)定的遺傳.值得注意的是在GM-gene-deletor系統(tǒng)中,當(dāng)Cre和PLP重組酶同時表達(dá)時,其刪除效率非常低.但是,當(dāng)重組酶Cre或FLP單獨(dú)表達(dá)時,其對外源基因的刪除效率達(dá)到了100%.Luo等[23]在煙草中利用來自擬南芥的熱誘導(dǎo)型啟動子Hsp18.2控制FLP重組酶表達(dá),刪除了位于2個loxP-FRT位點(diǎn)之間的異選擇標(biāo)記基因（ipt）、報告基因β-葡萄糖苷酸酶基因（gusA）以及FLP重組酶編碼基因,獲得無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因煙草.所構(gòu)建的GM-gene-deletor系統(tǒng)大大提高了包括選擇標(biāo)記基因以及改良植物抗性和品質(zhì)的目的基因在內(nèi)的所有外源基因的刪除效率（試驗證明其刪除效率可達(dá)到100%）,減輕了公眾對于轉(zhuǎn)基因作物或者食品的一系列擔(dān)憂.人們不必?fù)?dān)心轉(zhuǎn)基因作物中的標(biāo)記基因通過種子或花粉以“基因漂流”等方式流入自然界中,也不用擔(dān)心轉(zhuǎn)基因作物中攜帶的外源基因和蛋白對人體產(chǎn)生的副作用,有力地推動了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的商業(yè)化進(jìn)程.雖然,GM-gene-deletor可以將所有的外源功能基因進(jìn)行刪除,但是FLP酶切口處仍保留了一段86 bp的無蛋白質(zhì)編碼功能的loxP-FRT序列,這樣就仍然含有冗余的外源DNA序列.所幸的是,時至今日尚無有力證據(jù)表明這種“殘留”對于環(huán)境和人體健康具有威脅.

3 小結(jié)

研發(fā)和應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物安全技術(shù)體系,是轉(zhuǎn)基因植物研究健康發(fā)展的重要保障,也是推動轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化的重要突破口.FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)為無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的獲得提供了一個重要的手段.在應(yīng)用中,可以通過二次轉(zhuǎn)化或與含重組酶基因的轉(zhuǎn)基因植株雜交來組成性表達(dá)重組酶,或利用瞬時表達(dá)、誘導(dǎo)性表達(dá)、組織特異性表達(dá)重組酶來剔除選擇標(biāo)記基因.FLP/FRT位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)的不斷改善和發(fā)展一方面為農(nóng)作物復(fù)雜性狀的改良提供了可能,實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因植物的持續(xù)改良.另一方面,會一定程度上消除轉(zhuǎn)基因植物對人類健康和環(huán)境安全等方面造成的隱患,加速轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化.另外,FLP/FRT位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)發(fā)展在改進(jìn)植物表達(dá)載體、創(chuàng)建優(yōu)良的育種材料以及利用可控制的基因刪除技術(shù)研究基因的功能以及細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的研究等方面也日益凸顯其無可比擬的優(yōu)越性.盡管目前FLP/FRT位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)研究和應(yīng)用仍存在諸多不足,如融合2個位點(diǎn)的雜合系統(tǒng)反應(yīng)機(jī)制還缺乏充足的理論依據(jù)；FLP/FRT系統(tǒng)往往會因為該系統(tǒng)在某些種類的生物中較低的重組效率而受到影響.但隨著科研人員研究的不斷深入,FLP/FRT系統(tǒng)在后基因組時代基因功能的研究,特別是實(shí)現(xiàn)對靶基因的定點(diǎn)刪除與調(diào)控、生產(chǎn)具有商業(yè)價值的轉(zhuǎn)基因植物等生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的研究方面,必將發(fā)揮重要的作用.

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