孫華麟綜述，葉志中，尹志華審校

(深圳市第四人民醫(yī)院香蜜湖風濕病分院風濕免疫科廣東醫(yī)學院深圳風濕病研究所，廣東深圳518040)

miRNA在類風濕關(guān)節(jié)炎中的研究進展

孫華麟綜述，葉志中*，尹志華審校

(深圳市第四人民醫(yī)院香蜜湖風濕病分院風濕免疫科廣東醫(yī)學院深圳風濕病研究所，廣東深圳518040)

類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)病率隨著醫(yī)學檢測手段的提升而有所增高，研究類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制無論對患者還是醫(yī)學界都意義重大。本綜述著重研究miRNA在類風濕關(guān)節(jié)炎中的發(fā)病機制。

類風濕關(guān)節(jié)炎；miRNA；發(fā)病機制

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是最常見的結(jié)締組織病之一，我國初步調(diào)查顯示發(fā)病率為0.32%～0.40%，按調(diào)查顯示的發(fā)病率推斷，我國有RA患者400萬左右。我們曾對深圳地區(qū)進行風濕性疾病的流行病學調(diào)查，結(jié)果顯示RA的患病率為0.44%，而RA的誤診率、早期診斷率和不合理用藥率分別為35%、54%和46%[1]。早期、可靠的診斷對于采取適當?shù)闹委熆刂撇∏榈陌l(fā)展、避免不可逆的關(guān)節(jié)損傷是十分重要的。miRNA(MicroRNA，微小RNA)是一種長度約為18～25個核苷酸的內(nèi)源性、非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，并且具有高度同源性。從1993年首次在線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)miRNA，到現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)15 172種miRNA存在于各種生物體內(nèi)，存在于人體內(nèi)的有891種[2]。它可能調(diào)控著至少1/3的人類編碼蛋白基因。已經(jīng)有較多研究驗證miRNA參與了多個系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，包括腫瘤、自身免疫性疾病及心功能不全等，且Mitchell等[3]和Gilad等[4]的檢測結(jié)果表明血漿中的內(nèi)源miRNA分子和血清miRNA不僅為各種常見病種和疑難雜癥的研究開闊了思路和方向，并且其本身就具有極好的生物標志物的潛力。本綜述著重介紹miRNA與類風濕關(guān)節(jié)炎的最新研究進展。

1 miRNA的形成、成熟及其功能

miRNA被認為是從DNA轉(zhuǎn)錄、不被翻譯但能調(diào)控其他基因表達的分子。在動物體內(nèi)，miRNA的生成和成熟是一個逐漸變短的過程，這個過程主要有賴于兩種被稱作Drosha和Dicer的核酸酶Ⅲ的加工過程。首先，細胞核內(nèi)，在RNA聚合酶Ⅱ的幫助下，相應(yīng)基因被轉(zhuǎn)錄形成一種長鏈初始miRNA(pri-miRNA)，包含成熟miRNA序列和變化多端的側(cè)翼序列。然后，pri-miRNA被Drosha和它的合作蛋白DGCR8加工成前體miRNA(pre-miRNA)分子，與pri-miRNA不同的是，它大約有70個核苷酸長度，并帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，pre-miRNA由特定的核輸出蛋白Exportin5/RanGTP識別，并轉(zhuǎn)運至胞漿；在胞漿中，在Dicer的作用下，pre-miRNA進一步被加工成約21個核苷酸長度的雙鏈miRNA分子，其結(jié)構(gòu)與siRNA的結(jié)構(gòu)相似[5]。接著，其中一條單鏈選擇性的與miRNA誘導產(chǎn)生的沉默復(fù)合體(RISC)相連，目的是為了與RISC中目標mRNA的3'非翻譯區(qū)相互補，一旦轉(zhuǎn)錄后立即水平降解目標mRNA或抑制其進行翻譯[6]；另一條單鏈則被降解。通常一個基因可以被多個miRNA所調(diào)節(jié)，同時一個miRNA也可以調(diào)節(jié)多個mRNA。miRNA表達具有高度的保守性、時序性和組織特異性。一方面，miRNA主要通過影響mRNA的穩(wěn)定性或者抑制目標mRNA的翻譯過程在體內(nèi)參與多種細胞的增殖、成熟、分化[7]、凋亡[8]和類脂質(zhì)化合物代謝作用[9]以及器官形成[10]、胚胎發(fā)育，從而在生物體內(nèi)的各種生理過程中起著重要的調(diào)控作用；另一方面，還參與人類許多疾病的形成，在腫瘤疾病中，miRNA可以作為抑癌基因，當其表達降低時促進腫瘤發(fā)生；可以作為癌基因，當其表達增強時也促進腫瘤的發(fā)生，如在侵襲性B細胞白血病中miR-142表達缺失，在Burkitt淋巴瘤中miR-155表達異常增高等；miRNA還與心臟的發(fā)育有關(guān)，當小鼠失去miR-1-2時，就會改變其心臟的形態(tài)，也會影響到其心臟細胞數(shù)目的控制，參與研究的小鼠中有半數(shù)發(fā)生心室穿孔，但目前有關(guān)miRNA致病的詳細機制尚未完全明確。

2 miRNA與免疫調(diào)節(jié)

第一個被發(fā)現(xiàn)參與了免疫細胞成熟和分化的miRNA是miRNA-181a。Cuesta等[11]的研究證實通過調(diào)節(jié)p27mRNA的翻譯miR-181a可以達到調(diào)節(jié)髓源細胞成熟分化的目的。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在人體的某些與免疫功能相關(guān)的器官和細胞中都有所表達，如胸腺、脾臟、骨髓的前體細胞以及B220+細胞，其中在胸腺中表達最高，在后三者中表達明顯偏低；并且，當miR-181a在骨髓干細胞和前體細胞中異常表達時，不僅可以造成B細胞增殖，還使T細胞減少，主要是CD8+T細胞的減少。例如，Liu等[12]的研究證實胸腺前體細胞中高表達的miR-181a可以促進CD4CD8+T細胞的分化。深入研究顯示，一方面，miR-181a通過增強T細胞對抗原的敏感性對T細胞起調(diào)節(jié)作用；另一方面通過靶向針對Bcl-2、CD69及TCR起作用[7，13-14]。這些均說明miR-181a也參與了對T細胞的調(diào)節(jié)作用。

miR-155、miR-146是免疫系統(tǒng)中研究較多的兩種miRNA，現(xiàn)逐一介紹。在最初的研究中，人類B細胞淋巴瘤組織有高表達的miR-155[15]，從正面來證實：在miR-155轉(zhuǎn)基因鼠中，B細胞出現(xiàn)了惡變[16]，這些均提示miR-155可能參與調(diào)節(jié)了B細胞的增殖和分化；從反面來證實：對于miR-155基因敲除鼠，在B細胞方面，因其原始B細胞數(shù)目減少從而導致無法對原始刺激做出正常的免疫應(yīng)答，雖然其成熟B細胞的數(shù)目正常，但仍然出現(xiàn)了免疫缺陷；在T細胞方面，對于抗原的刺激，其體內(nèi)T細胞分泌IL-2及IFN-γ明顯減弱[16]，檢測T細胞的表達顯示該小鼠Th2細胞因子表達明顯升高，表明其體內(nèi)的T細胞表型趨向于Th2型[17-18]。另有研究已經(jīng)證實，miR-155對于CD4+Treg細胞的增殖分化是必須的。由此可見，miR-155不僅對B細胞的增殖分化起了重要的調(diào)節(jié)作用，對T細胞也是如此。

諸多報道指出，miR-146a表達于RA患者滑膜組織的T細胞中；另外，已有研究證實IL-17是RA患者病理損傷的一個重要因子，其在RA患者的滑膜組織中發(fā)現(xiàn)，但在OA患者的滑膜組織中并未發(fā)現(xiàn)。在Takuya等[19]的研究中，RA患者11名，OA患者10名?；颊逺A1、RA4的病情屬于高活動期，他們的IL-17、miR-146a的表達水平與其他患者相比是比較高的，且他們的IL-17、miR-146a表達水平是相似的。在早期RA患者和高活動期RA患者的外周血單核細胞(PBMC)和滑液組織中，miR-146a和IL-17的表達密切相關(guān)。對擴展產(chǎn)生IL-17的T細胞微陣列芯片分析提示包括miR-146a在內(nèi)的六種miRNA很明顯地上調(diào)了產(chǎn)生IL-17的T細胞分化過程，用實時定量PCR方法也證實了這一點。本實驗的雙著色步驟顯示miR-146+的細胞與IL-17融合了，因此提示產(chǎn)生IL-17的T細胞可以表達miR-146a，而產(chǎn)生IL-17的細胞來自于CD4+T細胞，他們還發(fā)現(xiàn)miR-146最初在CD68+的巨噬細胞中表達，后來也在RA患者滑膜組織的CD3+T細胞和CD79a+B細胞中表達，(miR-146a可以調(diào)節(jié)產(chǎn)生IL-17的T細胞，而在上述T、B細胞中又證實有miR-146a的表達)，這些均可以證明miR-146a可能間接地調(diào)節(jié)了T細胞和B細胞在RA中的表達。

3 miRNA與類風濕關(guān)節(jié)炎

類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以侵犯全身關(guān)節(jié)滑膜為主的慢性自身免疫性疾病，其主要特征為滑膜細胞過度增殖、滑膜細胞激活以及大量血管翳形成，造成骨、軟骨侵蝕性破壞，最終導致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。已有相關(guān)研究證實，炎癥性細胞因子包括IL-1、IL-17[19]、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與RA的起病和發(fā)展有著密切的關(guān)系。抑制上述因子可阻止疾病的進一步發(fā)展，抑制關(guān)節(jié)的進一步損傷，從而達到改善RA患者病情的作用。

2008年Stanczyk等[20]首先利用實時定量PCR方法檢測RA患者滑膜組織miR-155和miR-146a是表達上調(diào)的，還發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β等可誘導miR-155的產(chǎn)生，過表達的miR-155可以抑制MMP-3的產(chǎn)生。Kaleb等[6]的實驗顯示，在PBMC中RA患者miR-146a、miR-155、miR-132、miR-16的含量分別是健康對照組的2.6、1.8、2.0、1.9倍，但miRlet-7a的表達在RA與健康對照組間差異無統(tǒng)計學意義[21]。進一步研究miRNA的表達與RA活動性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-146和miR-16的高表達與RA的活動性有關(guān)，在RA的緩解期miR-146和miR-16低表達，這提示miR-146和miR-16可以作為RA活動性的檢測指標。日本學者Nakasa等[22]也用實時定量PCR和原位雜交方法證實了miR-146在RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中的表達，體外實驗發(fā)現(xiàn)滑膜纖維細胞在加入TNF-α和IL-1β培養(yǎng)后miR-146明顯升高，這說明miR-146a可能與RA中由TNF-α和IL-1β激活的炎癥反應(yīng)過程密切相關(guān)。

Nagata等[23]研究顯示，與對照組相比，RA模型鼠中的miR-15a的表達水平明顯降低，但其靶蛋白Bcl-2蛋白的表達則明顯升高，于是將去端肽膠原作為載體，將雙鏈miR-15a注入實驗組即RA模型鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)。首先通過熒光檢測證實miR-15a在其關(guān)節(jié)腔的存在，并能被滑膜細胞所攝取以及產(chǎn)生效應(yīng)；隨后檢測滑膜細胞凋亡的程度，注入3 d后利用caspase3檢測發(fā)現(xiàn)，模型鼠近關(guān)節(jié)腔處滑膜細胞上caspase3的表達增多，而對照組無明顯變化，表明注入的miR-15a可以通過誘發(fā)滑膜細胞凋亡來治療RA，這為以miRNA為靶治療RA提供了一定的參考價值。Nakamachi等[24]利用實時定量PCR檢測了156個miRNA在RA患者和骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者滑膜中的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-124a在RA中低表達，將miR-124a前體轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的RA滑膜細胞中，可以明顯抑制細胞的增殖并導致細胞在G1期生長阻滯，提示miR-124a在RA翻譯后調(diào)控機制中起著重要的作用。

Koichi等[25]的近期研究顯示，RA和OA患者其滑液中miR-16、miR-132、miR-146a、miR-223的含量明顯低于其血漿含量，且他們的滑液含量與血漿含量并沒有明顯相關(guān)性；RA患者其滑液miR-16、miR-146a、miR-155和miR-223的含量明顯高于OA患者。實驗還顯示血漿miRNA或是滑液miRNA與血漿miRNA相比，包括miR-16和miR-146a，均明顯與損失的關(guān)節(jié)數(shù)目和DAS28的評分密切相關(guān)。因此得出結(jié)論，滑液和血漿miRNA可以作為診斷RA和OA的一種潛在的生物標記，同時也可以作為分析他們的病理損傷的一種工具。

4 展望

綜上所述，miRNA與自身免疫性疾病存在著密切的聯(lián)系，它一方面參與了免疫細胞的增殖分化過程和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，另一方面參與了某些特定的組織損傷過程。雖然對于miRNA與免疫系統(tǒng)之間的作用有了一些初步的認識，但其具體作用機制尚有待進一步深究。隨著逐步揭示出這些作用機制，及早找出有早期診斷和治療價值的分子靶標，不僅為RA等免疫系統(tǒng)疾病的防治提供新策略，而且具有顯著的社會和經(jīng)濟意義。

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A

1003—6350(2012)08—126—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.08.059

2011-12-19)

國家自然科學基金（編號：81102266）；廣東省科技計劃項目(編號：2010B031600027)；深圳醫(yī)學重點建設(shè)項目(編號：2005C10)；深圳市科技局資助項目(編號：201002142)

孫華麟(1980—)，女，湖北省宜昌市人，住院醫(yī)師，在讀碩士。

*通訊作者：葉志中。E-mail:yezhizhong@126.com